華西醫(yī)院：神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦缺血的途徑和方法

近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)中心神經(jīng)疾病研究所研究人員在《Ibrain》發(fā)表了神經(jīng)干細(xì)胞注射治療腦缺血的途徑和方法，研究表明神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植治療是一種非常有前景的治療方法，移植的神經(jīng)干細(xì)胞不僅通過(guò)結(jié)構(gòu)替換發(fā)揮有益作用，還通過(guò)免疫調(diào)節(jié)和/或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用發(fā)揮有益作用。同時(shí)，NSC移植可減弱腦缺血后的細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能。由于NSCs可以通過(guò)多種途徑、不同劑量進(jìn)行移植，本文主要總結(jié)不同注射途徑和移植方法的NSCs移植效果。

神經(jīng)干細(xì)胞概述

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的來(lái)源及特點(diǎn)

NSCs是指具有自我更新能力并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和其他多向分化潛能的細(xì)胞。此外，這些顯示出惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)非常低。12種NSCs可直接來(lái)源于神經(jīng)組織：胚胎哺乳動(dòng)物的大腦皮層、海馬、紋狀體、室管膜下區(qū)、腦室下區(qū)、脊髓以及成年動(dòng)物的其他部位均已成功分離培養(yǎng)NSCs。此外，NSCs還可來(lái)源于胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎嗅鞘細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化。NSCs具有自我維持和增殖的能力，并具有多種細(xì)胞分化潛能。

神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦缺血的必要性

成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些區(qū)域的內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞主要分布在青壯年的海馬區(qū)和室管膜下區(qū)（SVZ）。然而，這些內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞處于休眠狀態(tài)。腦缺血會(huì)刺激海馬和髓鞘下區(qū)的細(xì)胞增殖和神經(jīng)母細(xì)胞形成，從而促進(jìn)內(nèi)源性NSCs遷移到缺血區(qū)域并分化為神經(jīng)元，融入受損區(qū)域發(fā)揮作用。然而，刺激成人內(nèi)源性NSCs對(duì)缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的恢復(fù)作用有限。

研究人員還利用各種體外培養(yǎng)方法獲得一定數(shù)量的外源性NSCs，而大多數(shù)外源性NSCs來(lái)自胚胎或胎兒。將人類(lèi)NSCs植入腦缺血大鼠的大腦，這些細(xì)胞可以遷移到缺血區(qū)域，增殖并分化成神經(jīng)元，還能改善感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能，從而顯著修復(fù)缺血性腦損傷。然而，將NSCs移植到人體仍處于實(shí)驗(yàn)研究的初級(jí)階段。雖然已經(jīng)取得了一些臨床結(jié)果，但技術(shù)還不夠成熟。目前仍缺乏大樣本、多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)和大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

神經(jīng)干細(xì)胞移植注射治療腦缺血的研究進(jìn)展

我們總結(jié)了NSCs的注射途徑，主要包括靜脈注射、動(dòng)脈注射以及經(jīng)腦室、紋狀體、胼胝體、大腦皮層、海馬和梗死區(qū)的腦內(nèi)注射（圖1）。下面我們主要介紹NSCs移植治療腦缺血的途徑、方法和劑量。

靜脈注射

• 尾靜脈
• 頸靜脈

表1：靜脈和動(dòng)脈NSC移植治療腦缺血的代表性實(shí)驗(yàn)研究。

動(dòng)脈注射

• 頸總動(dòng)脈
• 左頸總動(dòng)脈
• 頸外動(dòng)脈

腦內(nèi)注射

表2：腦內(nèi)（心室和紋狀體）NSC移植治療腦缺血的代表性實(shí)驗(yàn)研究。

心室注射

紋狀體注射

表3：腦內(nèi)（紋狀體）NSC移植治療腦缺血的代表性實(shí)驗(yàn)研究。

胼胝體注射

表4. 腦內(nèi)（胼胝體、大腦皮層和海馬）NSC移植治療腦缺血的代表性實(shí)驗(yàn)研究。

大腦皮層注射

海馬注射

梗塞面積區(qū)域

干細(xì)胞不同注射途徑和劑量的作用

細(xì)胞劑量和遞送時(shí)間

細(xì)胞劑量是最重要的變量之一。根據(jù)表1-3文獻(xiàn)試驗(yàn)回顧，不同研究的細(xì)胞劑量有所不同，一般在1×10³至1×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。例如，靜脈內(nèi)給藥的范圍為1×10³至1×10⁶個(gè)細(xì)胞。動(dòng)脈給藥范圍為1×10⁵至1×10⁶個(gè)細(xì)胞。中風(fēng)后3天移植NSC可促進(jìn)腦組織學(xué)的改善，被認(rèn)為是優(yōu)化神經(jīng)功能的有效方法。NSC成功地減少了梗塞面積的擴(kuò)大，并提供了最佳的神經(jīng)學(xué)結(jié)果。移植后7天后，腦內(nèi)接受高劑量1×10⁴細(xì)胞/μL和2×10⁶細(xì)胞/μLNSI-566RSC移植的中風(fēng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能顯著恢復(fù)（人類(lèi)NSC系）與注射媒介物的中風(fēng)動(dòng)物或接受低劑量5×10³個(gè)細(xì)胞/μL的中風(fēng)動(dòng)物進(jìn)行比較。

研究表明，干細(xì)胞治療的最佳時(shí)間是缺血性中風(fēng)后3天，造血干細(xì)胞移植可以通過(guò)防止細(xì)胞凋亡來(lái)縮小損傷范圍。此外，NSC移植可以抑制梗塞面積擴(kuò)大并保留神經(jīng)功能。然而，由于NSCs治療腦缺血受多種因素影響，NSCs移植的交付時(shí)間在不同情況下可能會(huì)有所不同。

不同注射途徑的比較

NSC移植尚無(wú)最佳注射途徑。將干細(xì)胞輸送到全身的問(wèn)題在于，僅位于損傷部位的注射細(xì)胞數(shù)量非常有限。直接注射是侵入性的，雖然它是一種精確的細(xì)胞輸送和植入方法，但它會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在目標(biāo)病灶中分布不良。

靜脈移植的人類(lèi)NSC可以到達(dá)患有缺血性損傷的成年大鼠大腦，并改善功能恢復(fù)和長(zhǎng)期安全性。靜脈注射后，細(xì)胞分布于全身，包括肝臟、脾臟、腎臟和脊髓。這導(dǎo)致輸送到大腦的細(xì)胞數(shù)量減少。

頸動(dòng)脈注射可以避免這種情況。

動(dòng)脈注射的優(yōu)點(diǎn)在于，它利用中樞神經(jīng)系統(tǒng)的首過(guò)效應(yīng)，最大限度地發(fā)揮外源性神經(jīng)細(xì)胞在大腦中定居的潛力，而周?chē)募?xì)胞首先通過(guò)肺等過(guò)濾器官豐富的微循環(huán)和肝臟。但也存在潛在的并發(fā)癥：動(dòng)脈內(nèi)注射可能會(huì)導(dǎo)致容量超負(fù)荷，從而導(dǎo)致急性心臟超負(fù)荷和肺水腫。當(dāng)快速注射時(shí)，這些風(fēng)險(xiǎn)會(huì)被放大并對(duì)血管壁造成損害。因此，總?cè)萘亢退俣榷紤?yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待，進(jìn)一步阻塞或干擾毛細(xì)血管。另一個(gè)并發(fā)癥是腦血管系統(tǒng)中NSC栓塞的形成。將細(xì)胞直接注入腦室需要用電鉆進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)，這會(huì)造成嚴(yán)重的創(chuàng)傷。與腦室內(nèi)注射和靜脈注射相比，頸內(nèi)注射顯示出特殊的優(yōu)勢(shì)，直接促進(jìn)細(xì)胞間接觸并誘導(dǎo)TNT形成，并且在動(dòng)物模型中死亡風(fēng)險(xiǎn)低于腦室內(nèi)注射。

此外，立體定向顱內(nèi)移植是將NSCs直接注射到受損區(qū)域。該路線的效果比上述方法要好。但這種方法是侵入性的，涉及開(kāi)顱手術(shù)等一系列手術(shù)，因此可能會(huì)損傷附近的腦組織。因此，迫切需要尋找一種能夠有效穿透大腦的非侵入性藥物輸送方法。盡管治療中樞系統(tǒng)疾病的鼻內(nèi)藥物輸送已經(jīng)存在很長(zhǎng)時(shí)間，但使用干細(xì)胞的鼻內(nèi)藥物輸送只是在最近幾年才得到研究。

丹尼爾揚(yáng)等人。2009年發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)輸送干細(xì)胞可以穿透小鼠大腦并繞過(guò)血腦屏障（BBB），這是一種非侵入性途徑。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)表明干細(xì)胞可以通過(guò)鼻內(nèi)給藥繞過(guò)血腦屏障可靠地遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭校莾?nèi)施用間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)潛力已被廣泛報(bào)道。例如，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (hUC-MSC) 促進(jìn)大鼠缺氧/缺血引起的新生兒腦損傷的修復(fù)。然而，使用鼻內(nèi)NSC治療腦缺血的方法仍在探索中。幸運(yùn)的是，紀(jì)剛等人發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)移植人類(lèi)NSC可以改善患有缺氧缺血性腦病的新生大鼠的神經(jīng)功能。因此，鼻內(nèi)給予NSCs可能是治療腦缺血的一種有前途的無(wú)創(chuàng)方法。

神經(jīng)干細(xì)胞移植的重要性

神經(jīng)干細(xì)胞移植后，身體各方面都得到了改善。根據(jù)移植后NSC的神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分，我們可以得到顯著較低的神經(jīng)嚴(yán)重程度評(píng)分（NSS），這證明NSC移植減輕了腦缺血，增強(qiáng)了神經(jīng)功能。此外，它還能改善神經(jīng)干細(xì)胞的遷移，對(duì)腦缺血有有益的作用。同時(shí)，移植后神經(jīng)功能得到增強(qiáng)。

此外，NSCs遷移到缺血腦中后仍保持增殖能力，可在缺血環(huán)境下維持至少14天的強(qiáng)大增殖能力。NSC還可以抑制缺血引發(fā)的炎癥細(xì)胞因子并減少腦梗塞的體積。NSC移植刺激老年缺血大鼠的神經(jīng)發(fā)生和內(nèi)源性血管生成。同時(shí)還能促進(jìn)皮質(zhì)梗死區(qū)的血管生成，使NSC在體內(nèi)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而參與神經(jīng)組織的修復(fù)。此外，它們可以通過(guò)跨胚分化分化為非神經(jīng)細(xì)胞。移植胎兒NSC的動(dòng)物不僅在肢體放置測(cè)試和功能評(píng)分方面表現(xiàn)出明顯更好的表現(xiàn)，而且在體外和體內(nèi)條件下分化為軸突、樹(shù)突和星形膠質(zhì)細(xì)胞方面也表現(xiàn)出明顯更好的表現(xiàn)。

神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合輔助治療方法

有很多方法可以用來(lái)促進(jìn)NSC移植的效果。一些方法如下：BDNF-NSCs移植后進(jìn)行神經(jīng)功能?chē)?yán)重程度評(píng)分，更大程度改善神經(jīng)功能。

環(huán)狀RNA-HIPK2 (CircHIPK2) 表達(dá)的沉默可以增強(qiáng)中風(fēng)后的功能恢復(fù)和 NSC向神經(jīng)元的分化，并促進(jìn)神經(jīng)元的可塑性。同時(shí)，將AF-NSCs移植到缺血大鼠體內(nèi)并誘導(dǎo)功能恢復(fù)。miR-145通過(guò)靶向絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路保護(hù)神經(jīng)元干細(xì)胞功能并增強(qiáng)NSCs活性來(lái)治療大鼠腦缺血性中風(fēng)。miR-145的過(guò)表達(dá)促進(jìn)NSCs的增殖和分化，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。

iPSC衍生的NSC立體定向植入大腦后，植入的細(xì)胞可以存活、遷移到缺血的大腦區(qū)域并分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。針刺+NSCs移植后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，NSCs存活率增加。CoMo-NSCs在體外有效地自我更新并生成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

DAPT可促進(jìn)移植的NSCs分化為神經(jīng)元，對(duì)腦缺血大鼠NSCs移植具有神經(jīng)保護(hù)作用。PCNSC移植增強(qiáng)了缺血性中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)作用。最后，預(yù)處理將進(jìn)一步增強(qiáng)NSC移植后NSC的效果。

結(jié)論

本綜述重點(diǎn)討論NSC注射治療腦缺血的各種方法、劑量、時(shí)機(jī)和效果。腦缺血后NSCs移植的最佳注射部位、時(shí)機(jī)和劑量仍存在爭(zhēng)議，因?yàn)镹SCs注射的效果受到多種因素的影響。

從注射途徑來(lái)看，靜脈注射和動(dòng)脈注射都是無(wú)創(chuàng)的。腦內(nèi)和立體定向注射是侵入性的，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的創(chuàng)傷，特別是在腦內(nèi)注射時(shí)。腦內(nèi)立體定向注射比其他方法更有效，但臨床風(fēng)險(xiǎn)更大。雖然鼻內(nèi)給藥是一種無(wú)創(chuàng)遞送方法，但鼻內(nèi)給藥NSCs治療腦缺血的研究較少，這可能是治療腦缺血的一種有前途的替代細(xì)胞療法。

在細(xì)胞劑量方面，不同的研究有不同的細(xì)胞劑量，一般為1×103–1×106個(gè)單元。從注射時(shí)機(jī)來(lái)看，干細(xì)胞治療的最佳時(shí)間是缺血性中風(fēng)后3天左右。然而，最佳注射時(shí)間可能因多種因素而異。此外，移植和推廣干細(xì)胞衍生物也是提高移植NSCs存活率的策略。總而言之，這些將干細(xì)胞和/或治療物質(zhì)遞送至受損部位的給藥途徑需要進(jìn)一步優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)更好的臨床應(yīng)用。

參考資料：

Yang, X-Y, Zhang, X, Cao, J-F, Wu, M, Chen, S-Y, Chen, L. Routes and methods of neural stem cells injection in cerebral ischemia. ibrain. 2023; 1-14. doi:10.1002/ibra.12122

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