提高間充質干細胞治療呼吸系統疾病的效果的方法有哪些？

由于具有抗炎、抗凋亡、抗菌和抗纖維化特性，間充質基質細胞 (MSC) 被認為是治療呼吸系統疾病的一種有前途的替代方法。盡管 MSC 給藥已在臨床試驗中被證明是安全的，但迄今為止，很少有研究表明MSC對呼吸系統疾病有效。

提高間充質干細胞治療呼吸系統疾病的效果的方法有哪些？

本綜述介紹了增強MSC有益作用的策略，包括預處理（在缺氧、氧化應激、熱休克、血清剝奪和暴露于炎性生物樣品下）和基因操作。這些策略可以通過誘導細胞保護基因的表達來不同程度地促進MSC存活率的提高，并通過改善修復因子的分泌來提高MSC的效力。此外，這些策略已被證明可以增強MSC在臨床前肺病模型中的有益作用。然而，要將這些策略從實驗室轉化為臨床，還有很長的路要走。

間充質干細胞在治療呼吸系統疾病中的潛力

間充質基質細胞（MSC）處于再生醫學領域前沿。其有明確特征，人類MSC培養時會粘附在塑料上，表達特定細胞表面標志（如CD105、CD90、CD73），缺乏另一些標志（如CD45、CD34、CD14），且在誘導劑存在下能體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞。過去十年還證實其具備免疫調節特性，可抑制多種免疫細胞（巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞以及B和T淋巴細胞）的增殖、成熟和分化。

MSC通過多種機制減輕炎癥，

• 一是通過在細胞外囊泡等部位分泌旁分泌/內分泌介質（如激素、細胞因子、生長因子等），這些分泌因子有抗炎、抗凋亡等多種活性；
• 二是借助細胞間接觸，靠配體與受體識別影響免疫細胞；
• 三是通過細胞器轉移（如線粒體）來發揮作用。

鑒于上述機制，MSC被視作肺部疾病（如急性呼吸窘迫綜合征、過敏性哮喘、肺氣腫、矽肺病等）的潛在療法，相關臨床前研究中展現出的有益作用推動了臨床試驗開展。雖然臨床試驗表明其安全性良好，但MSC治療的潛在功效有限，這可能是受接種量少（圖1a)、在肺部疾病病程晚期給藥、體內存活率低（圖1b）以及效力/生物活性受損（圖1c）等多種因素影響。

a：接種的MSC數量少。此外，盡管MSC在全身給藥后很容易被困在肺毛細血管中，但無法長期保留。因此，修復因子的數量逐漸減少。

b：MSC易受炎癥微環境毒性的影響，導致體內存活率低。剩余的少數存活MSC可能不足以發揮足夠的治療效果。

c：盡管MSC存活且數量充足，但它們的效力可能仍然較低，即缺乏減輕炎癥或修復受損組織的活性或有效性。

MSC在肺部的植入是細胞治療面臨的一大阻礙，據估算，MSC在24小時內就會從肺組織中被清除。目前主要測試了兩種解決該問題的策略：

一是讓MSC過表達表面受體CXCR-4，其能與基質細胞衍生因子1相互作用，以此支持MSC歸巢至受損部位，使得在急性肺損傷模型中，更多MSC可進入并定居肺部；

二是采用磁靶向技術將MSC募集到肺組織中，不過該技術雖能提高48小時后的細胞保留率，但其有效性尚未得到確切評估。

另外，為提高MSC的存活率或效力以增強其有益作用，也提出了兩種策略。

其一是預處理，它以生物學興奮效應概念為基礎，即讓MSC短暫接觸低劑量的有毒或致命藥劑來產生有益效果（如應激耐受性生長或長壽）；

其二是基因操作，通過質粒轉染、病毒載體轉導或運用miRNA、小干擾RNA（siRNA）來對參與細胞存活途徑和免疫調節的基因進行調節。

而本綜述旨在描述并討論上述這些策略，以及它們在實驗環境中是怎樣對肺部疾病治療起到促進作用的。

提高間充質干細胞存活率的策略

MSC療法要想成功，需要有合適數量的細胞，為此會在含富含生長因子的動物血清的培養基里對MSC進行體外擴增。但連續復制、培養條件以及凍融等情況可能會給細胞帶來損害，導致它們在面對受損組織的惡劣環境時更為脆弱。

近期有數據表明，新鮮解凍的MSC可能無法具備與新鮮培養的MSC相同的效果以及抗炎活性范圍，不過也有研究小組報告稱，在實驗性過敏性哮喘中，解凍的MSC和新鮮培養的MSC效果一樣。

所以，還需要進一步深入研究，去評估新鮮和解凍的MSC在不同疾病模型以及不同體內環境下的有效性情況。 預處理策略已經被拿來測試，目的是保護MSC免受受損環境影響，進而提升其存活率。部分研究聚焦于MSC在亞致死性暴露于細胞應激源（比如缺氧、高溫、營養耗竭等）時的反應（圖2），這些應激源與缺血或炎癥微環境類似，它們被視作是體內細胞存活面臨的主要挑戰。

除了預處理外，還嘗試操縱與重要細胞周期、細胞凋亡和細胞存活途徑有關的基因，以嘗試提高MSC存活率。例如，過表達肝細胞生長因子 (HGF) 的MSC在體內表現出存活率提高，其效果已在肺損傷模型中得到測試。

提高間充質干細胞存活率的預處理策略

缺氧預處理

缺氧預處理能夠讓 MSCs 在缺血性微環境中存活，對于治療與氣體交換障礙（如急性呼吸窘迫綜合征、肺氣腫、哮喘和肺纖維化等）相關的肺部疾病有較好效果。在肺纖維化模型中，和常氧條件下培養的 MSCs（NP-MSCs）相比，缺氧預處理的 MSCs（HP-MSCs）在減輕博來霉素引起的氣道收縮、肺水腫以及纖維化變化等方面效果更顯著，并且通過使用 lacZ 報告基因的 MSC 轉導評估細胞存活率發現，HP-MSC治療組在18天后肺組織中的lacZ mRNA含量比NP-MSC組高出三倍，由此推測肺功能和組織學的改善或許與缺氧預處理提高MSC存活率相關。

通過氧化應激暴露、熱休克蛋白和血清剝奪進行預處理

通過暴露于氧化應激、熱休克蛋白、血清剝奪這幾種方式對間充質基質細胞（MSC）進行預處理的策略，尚未在肺病模型中開展測試，但體外和體內研究結果顯示這些策略具備應用潛力。

氧化應激預處理

• 作用及效果：氧化預處理不僅能促進細胞保護作用，還可提高MSC效力。先前讓MSC暴露于非致死濃度的過氧化氫（20和50μM）時，其對致死劑量該化合物的抵抗力更強，對照組（0μM）約60%的MSC處于細胞凋亡狀態，而20和50μM組分別約30%和40%處于凋亡狀態。
• 分子機制：其細胞保護涉及的分子機制是MSC線粒體瞬時釋放活性氧（ROS），進而激活細胞外信號調節激酶（ERK）通路，該通路能促進如Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達，此策略或許有助于治療以肺部微環境中ROS釋放為特征的炎癥疾病（如急性呼吸窘迫綜合征、矽肺病等）。

熱休克預處理

• 效果表現：熱休克預處理是增加MSC存活率的一種有效方法。將MSC暴露于42°C下60分鐘，可使熱休克蛋白-27（HSP-27）和熱休克蛋白-90（HSP-90）表達分別增加4.8倍和17.4倍。
• 作用機制及局限：這些熱休克蛋白通過激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K/AKT）、細胞外信號調節激酶（ERK）和核因子κB（NF-κB）等信號通路促進MSC存活，但盡管熱休克預處理的MSC有潛在應用價值，卻從未在體內進行過測試。

血清剝奪（SD）預處理

• 目的及效果：血清耗竭預處理旨在讓MSC處于靜止狀態以減少能量需求，利于其在缺血環境中存活。在相關報告中，讓MSC在無胎牛血清情況下培養48小時后植入動物體內，在缺血條件下維持3和7天，通過流式細胞術檢測發現，與對照組相比，SD預處理組在第3天和第7天的MSC活力分別增加了四倍和三倍。
• 機制闡釋：在SD預處理期間，生長因子缺失會抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路（更具體說是mTOR復合物1，即mTORC1），mTORC1會抑制自噬等分解代謝過程，而經過48小時SD預處理后，MSC內源性自噬體標志物LC3B-II蛋白水平高于對照細胞，且當自噬受到抑制時，半數MSC在缺血條件下培養7天后死亡，所以經此預處理的MSC存活率提高可能得益于保護性自噬過程。

運用基因操作提升間充質干細胞存活率的情況

多種遺傳方法被用于提高間充質基質細胞（MSC）的存活率，雖然多數此類方法旨在增強MSC對缺血環境的抵抗力以改善心肌梗死治療，但肝細胞生長因子過表達的MSC（HGF-MSC）也在急性肺損傷模型中進行了測試。肝細胞生長因子（HGF）本身是一種具備抗炎、抗凋亡以及修復特性的生長因子。

HGF-MSC在細胞凋亡及效力方面的表現

• 細胞凋亡情況：在體外將細胞暴露于過氧化氫（120μM）4小時后，HGF-MSC的凋亡率低于未修飾的細胞（HGF-MSC的Annexin-V陽性細胞占比為25.3%，而未修飾細胞為64.6%），且在體內，HGF過表達后，凋亡細胞數量近乎減少了一半，不過HGF提升MSC存活率的具體機制還有待進一步闡明。
• 細胞效力提升表現：HGF的上調還提高了MSC的效力。與野生型MSC相比，HGF-MSC使肺組織中的HGF水平得以提高，并且改善了氧合情況（動脈血氧分壓，PaO?水平方面，HGF-MSC為104.62±10.5 mmHg，野生型MSC為90.30±8.8mmHg），降低了肺損傷評分（HGF-MSC為0.3，野生型MSC為0.55），減少了中性粒細胞浸潤（髓過氧化物酶活性方面，HGF-MSC約為600 mU/g，野生型MSC約為700 mU/g），提高了超氧化物歧化酶（SOD）水平，還上調了白細胞介素-10（IL-10，HGF-MSC約增加4倍，野生型MSC約增加2倍）。

關于凋亡間充質干細胞的相關情況

已測試了多種策略來提高MSC在體內的存活率，不過值得注意的是，有報告顯示即便處于凋亡狀態的MSC也具備免疫調節活性。比如在哮喘模型中，注射10?個凋亡的MSC相較于存活的MSC以及未進行治療的情況，發揮了免疫抑制作用，使支氣管肺泡灌洗液（BAL）中的嗜酸性粒細胞浸潤顯著減少一半；在膿毒癥模型中，用凋亡的MSC進行治療可改善動脈血氧飽和度，并減少肺損傷（體現為肺重與體重比方面，凋亡MSC治療時約為0.45 × 10?2，對比情況約為0.4×10?2），但凋亡的MSC改善治療結果的作用機制目前仍不清楚。

提高間充質干細胞效力的策略

MSC“效力”被定義為其生物活性的量度；它也是治療效果與達到治療效果所需的MSC劑量之間的關系。MSC效力低可能是MSC在體外擴增過程中表型發生變化的結果。此外，MSC不會自發產生免疫抑制；需要事先激活才能提高其效力。因此，了解導致MSC激活的機制非常重要。

炎癥環境中影響MSC的相關因素

在存在炎癥的微環境里，巨噬細胞和中性粒細胞會釋放諸如干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1、趨化因子、白三烯以及自由基等促炎介質，間充質基質細胞（MSC）能夠“感知”這些介質，進而激活核因子κB（NF-κB），促使免疫調節和修復因子的表達增多。

此外，還有其他因素可激活MSC，例如微生物相關分子模式能通過Toll樣受體（TLR），像TLR3和TLR4來激活MSC。其中，通過脂多糖（LPS）激活TLR4會誘導產生促炎性MSC表型，使其分泌IL-6、IL-8和轉化生長因子（TGF）-β；而通過聚肌苷酸：聚胞苷酸（poly I:C）激活TLR3則會誘導出抗炎性MSC表型，使其表達吲哚胺2,3-雙加氧酶、前列腺素（PG）E2、IL-4和白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）。

基于炎癥環境的提高MSC效力的策略

提高MSC效力的首個策略是在炎癥環境中對其進行預處理。就肺部疾病而言，中度至重度急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者的混合血清被當作激活MSC的炎癥背景來使用。這種血清含有高水平的IL-10、IL-8和IL-6，以及低水平的IL-1β、TNF-α和IFN-γ。當使用0.5%的ARDS血清對MSC預處理16小時后，與對照MSC相比，MSC的IL-10（約為5倍）和白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RN，約為2.5倍）的表達顯著增加，并且ARDS血清還能降低促炎介質的表達（詳見表1）。

使用其他物質進行預處理

人們對探索提高 MSC 效力的替代方法很感興趣，最近的研究已經探討了MSC與其他物質的結合。這些物質包括吡格列酮、N?-乙酰半胱氨酸和粉防己堿（表1）。

基因操作增強MSC

多種促有絲分裂、抗凋亡以及抗炎因子已被高效轉導至間充質基質細胞（MSCs）中，這些經過基因操控的細胞在急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、肺動脈高壓（PAH）以及慢性阻塞性肺病的實驗模型中接受了測試。

針對ARDS進行基因轉導的情況 ARDS是此類技術常見的治療目標，為有效逆轉炎癥過程，MSCs被轉導了以下幾種基因：

• 發育內皮基因座1（Del-1）：它是內皮細胞分泌的一種糖蛋白，在細胞遷移和浸潤方面起著關鍵作用。
• ST2受體基因（sST2）：作為白細胞介素-33（IL-33）的捕獲受體，IL-33-ST2軸在肺部炎癥期間連接著先天性和適應性免疫反應。
• 血管緊張素轉換酶2（ACE-2）：該酶能夠降低血管緊張素-2（Ang-2）水平，而Ang-2是ARDS發病機制中的重要介質。
• 錳超氧化物歧化酶（MnSOD）：其可保護線粒體免受活性氧（ROS）的侵害。

轉導基因的MSCs在小鼠ARDS模型中的效果

在小鼠ARDS模型中測試時，轉導了上述基因的MSCs展現出諸多積極效果，具體表現為：

• 顯著降低：肺損傷指數、中性粒細胞計數、促炎細胞因子（如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-β和/或白細胞介素-6）水平以及支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白質含量。
• 部分提升與改善：提高了抗炎細胞因子白細胞介素-10的水平，減少了肺水腫以及肺組織中的細胞凋亡率，還提高了小鼠的生存率（相關效果總結于表2中）。

重要的是，轉基因基質細胞在臨床環境中的應用即將成為現實。轉基因細胞已獲批準，目前正在用于肺動脈高壓患者的早期臨床研究，如肺動脈高壓和血管生成細胞治療 (PHACeT) 試驗。

結論

間充質干細胞在再生醫學領域具有潛力。然而，MSC在呼吸系統疾病方面的臨床試驗的主要結果遠遠低于這些細胞在臨床前研究中的理論潛力。將MSC移植轉變為一種有效的程序是一項巨大的挑戰。研究人員一直在尋找替代且有效的策略來提高植入MSC的存活率和免疫調節能力，從而增強組織修復。然而，盡管如本綜述所述，有大量的實驗證據表明存在一系列改善MSC功能的策略，但這些技術要從實驗室應用到臨床應用還有很長的路要走。

參考資料：Silva, L.H.A., Antunes, M.A., Dos Santos, C.C.?et al.?Strategies to improve the therapeutic effects of mesenchymal stromal cells in respiratory diseases.?Stem Cell Res Ther?9, 45 (2018). https://doi.org/10.1186/s13287-018-0802-8

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