同濟醫(yī)院：神經干細胞成為神經退行性疾病和中風的新療法

前言：由于成年哺乳動物大腦的自我修復和再生能力有限，以不可逆的細胞損傷為特征的神經系統(tǒng)疾病，特別是神經退行性疾病和中風，通常被認為是難治性疾病。

神經干細胞（NSC）因其自我更新和形成不同神經譜系細胞（如神經元和神經膠質細胞）的能力，在神經系統(tǒng)疾病的治療中發(fā)揮著獨特的作用。隨著對神經發(fā)育認識的不斷深入和干細胞技術的進步，可以從不同來源獲得神經干細胞，并定向分化為特定的神經譜系細胞表型，使得替代某些神經系統(tǒng)疾病中丟失的特定細胞成為可能，這提供了新的途徑。

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同濟醫(yī)院：神經干細胞成為神經退行性疾病和中風的新療法

近日，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經內科聯(lián)合武漢大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室對神經干細胞移植治療神經退行性疾病和缺血性中風進行了新研究。

研究結果發(fā)表在《自然》子刊“cell death discovery”上，文章證實了

• 不同來源的神經干細胞可以在體外被誘導分化為成熟且有功能的神經元或神經膠質細胞。
• 移植預分化神經干細胞可以分化成熟為特定類型的細胞，促進神經退行性疾病或中風模型的恢復。
• 目前，來自人類胚胎干細胞的多巴胺能神經元經過神經干細胞階段，正在帕金森病患者的臨床試驗中進行測試。

在本綜述中，我們總結了體外誘導不同來源的神經干細胞分化的策略。然后，我們概述了移植的預處理 神經干細胞在帕金森病和缺血性中風模型中的功能改善和潛在機制。此外，我們還討論了定向誘導神經干細胞在神經系統(tǒng)疾病和缺血性中風的臨床轉化中的局限性。

開放式問題

• 對于神經退行性疾病或中風，哪種神經干細胞來源和哪種定向分化方法將使移植細胞符合良好生產規(guī)范指南？

• 移植神經干細胞分化的最佳時間窗是多少？
• 移植的預分化神經干細胞的細胞替代的潛在機制是什么？

什么是神經退行性疾病？

神經退行性疾病（ND）是一組以神經元結構或功能逐漸喪失為特征的疾病，包括帕金森病（PD）、阿爾茨海默病（AD）、肌萎縮性側索硬化癥（ALS）和亨廷頓病（HD）等。這些疾病不僅對患者的生命構成威脅，還給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。目前，針對ND的治療主要集中在緩解癥狀和延緩病程，但無法實現(xiàn)治愈。

神經干細胞移植通過神經修復與再生治療成為神經系統(tǒng)疾病的理想方法

神經修復再生療法是治療神經系統(tǒng)疾病的理想方法，其中神經干細胞（NSCS）移植策略在ND治療中引起了越來越多的關注。

神經干細胞是一類多能細胞，具有強大的自我更新能力和分化為各種中樞神經系統(tǒng)（CNS）神經元和神經膠質細胞類型的能力。神經干細胞移植在多種病理條件下已被證實，例如癲癇、MS、缺血性中風和AD。基于NSC的療法已在許多ND和缺血性中風的嚙齒動物模型中得到實施，一些研究提出了NSC改善疾病的潛在機制，包括神經炎癥抑制、神經元替代、免疫調節(jié)和神經營養(yǎng)支持，從而促進ND和中風模型的恢復。

神經干細胞移植策略作為再生醫(yī)學的一種，在NDs的治療中受到越來越多的關注。此外，隨著干細胞領域的進步，用于移植的NSCs來源已從最初的直接分離腦組織擴展到多能干細胞（PSCs）的分化和體細胞的轉分化。迄今為止，基于NSC的療法已在許多ND和缺血性中風的嚙齒動物模型中實施，并且一些研究提出了解釋NSC改善疾病作用的潛在機制，包括神經炎癥抑制、神經元替代、免疫調節(jié)和神經營養(yǎng)支持，從而促進ND和中風模型的恢復。

然而，直接移植NSC面臨低存活率和不合理分化的挑戰(zhàn)。在ND和缺血性中風中，中樞神經系統(tǒng)先天免疫細胞的慢性或急性激活可以觀察到，神經炎癥反應誘導的宿主微環(huán)境可能在移植NSC的存活和分化中起著關鍵作用。此外，參與炎癥途徑的自噬已被證明可以調節(jié)移植NSC的分化。因此，炎癥反應可能會對移植NSC參與功能恢復的能力產生不利影響。

為了克服直接移植NSC的局限性，并考慮到某些ND具有特定細胞類型丟失的病理特點，人們致力于探索移植前操控NSC命運以控制終末譜系從而替代ND丟失細胞的可行性。通過化學定義系統(tǒng)或異位過表達關鍵的譜系特異性轉錄因子，不同來源的NSC可以在體外定向分化為特定類型的神經譜系細胞，如DA能神經元、GABA能神經元、膽堿能運動神經元、少突膠質細胞、谷氨酸能神經元等。隨后的研究已經進行了預分化細胞的體內移植，以探討其在神經系統(tǒng)疾病中的治療作用（圖1）。

不同來源神經干細胞體外定向分化

神經干細胞（NSC）的獲取可以通過三種不同的方式實現(xiàn)：從原代中樞神經系統(tǒng)（CNS）組織直接提取、從多能干細胞（PSC）分化以及從體細胞轉分化（圖2）。以下是這三種方法的詳細說明：

從原代CNS組織直接提取NSC：

• NSC在發(fā)育中的大腦中廣泛存在，而在成年哺乳動物的大腦中，它們主要位于海馬的顆粒下區(qū)、腦室下區(qū)以及整個腦室系統(tǒng)的多個部位。從這些區(qū)域可以分離出NSC，這些細胞具有自我更新和多向分化潛能。

PSC分化為NSC：

• PSC，包括胚胎干細胞（ESC）和誘導性多能干細胞（iPSC），可以通過體外誘導分化為NSC。主要有兩種方法：胚狀體（EB）形成和貼壁單層培養(yǎng)。
• 神經分化過程是多步驟的，首先通過去除促進自我更新的介質來觸發(fā)向所有三個胚層分化，隨后抑制胚外和中胚層內胚層分化，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以利于神經分化。
• 雙重SMAD抑制（同時抑制轉化生長因子β和BMP信號通路）可降低培養(yǎng)變異性并提高神經誘導效率。
• PSC的神經誘導也可以通過與基質細胞飼養(yǎng)層共培養(yǎng)來實現(xiàn)，這可以為限制PSC向神經譜系的命運提供線索。

從體細胞轉分化為NSC：

• 誘導性NSC可以直接從體細胞（如外周血單核細胞（PBMNC）、成纖維細胞和其他細胞類型）重編程。
• 這種轉分化技術允許從患者自身的體細胞中生成NSC，這對于個性化醫(yī)療和避免免疫排斥反應具有重要意義。

不同來源的NSC可以被誘導分化為所需的神經譜系細胞，這為研究和治療神經系統(tǒng)疾病提供了多種可能性。每種方法都有其獨特的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，選擇合適的方法取決于具體的應用需求和研究目標。

目前，NSCs可通過三種途徑獲得：1）從原代中樞神經系統(tǒng)組織中分離，主要包括成人和胎兒的腦組織；2）通過EB形成或單層培養(yǎng)從多能干細胞（iPSC和ESC）分化，雙重SMAD抑制可以促進神經誘導過程；3）由體細胞轉分化，如血細胞和成纖維細胞。CNS中樞神經系統(tǒng)、EB胚狀體、ESC胚胎干細胞、IPSC誘導多能干細胞。

了解神經系統(tǒng)的自然發(fā)育對于操控神經干細胞（NSC）的定向分化至關重要。在胚胎發(fā)育過程中，神經管沿背腹軸和前后軸經歷精確的模式化過程，這一過程由組織者（即釋放模式化分子來調節(jié)NSC命運的小細胞群）調控。以下是一些關鍵點，概述了這一過程和相關的模式化分子：

模式化分子的作用：

• 成纖維細胞生長因子（FGF）、無翅型MMTV整合位點家族（WNT）和視黃酸（RA）參與前后模式化。
• WNT、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和音猬因子（SHH）影響背腹模式。

形態(tài)發(fā)生素梯度：

• 形態(tài)發(fā)生素的梯度可以調節(jié)定義轉錄代碼的內在信號通路。

體外誘導NSC分化的方法：

• 化學定義系統(tǒng)：通過模仿體內神經發(fā)育的區(qū)域模式原理，在體外誘導不同來源的NSC分化。
• 內在轉錄因子介導的方法：通過該方法可以產生所需的神經譜系細胞類型，例如多巴胺能（DA）神經元、中腦棘狀γ-氨基丁酸介導（MSN）神經元、膽堿能運動神經元、少突膠質細胞和皮質谷氨酸能神經元。

神經誘導過程：

• PSCs（包括ESCs和iPSCs）的神經分化過程是多步驟的，首先通過去除促進自我更新的介質來觸發(fā)向所有三個胚層分化，隨后抑制胚外和中胚層內胚層分化，并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞以利于神經分化。
• 雙重SMAD抑制（同時抑制轉化生長因子β和BMP信號通路）可降低培養(yǎng)變異性并提高神經誘導效率。

神經誘導的相似性：

• 這兩種人類PSC的神經誘導方法與體內神經誘導過程非常相似，從而產生具有背前腦身份的NSC。

共培養(yǎng)方法：

• PSC的神經誘導也可以通過與基質細胞飼養(yǎng)層共培養(yǎng)來實現(xiàn)，這可以為限制PSC向神經譜系的命運提供線索。

到目前為止，已開發(fā)出兩種主要的誘導分化方法：化學定義系統(tǒng)和內在轉錄因子介導的方法，通過該方法可以產生所需的神經譜系細胞類型，例如 DA 能神經元、MSN、膽堿能運動神經元、少突膠質細胞和皮質谷氨酸能神經元（圖3)。

神經干細胞誘導定向分化在神經系統(tǒng)疾病模型中的治療潛力

目前涉及的主要神經疾病模型包括PD、HD、MS、ALS和缺血性中風。在這里，我們主要概述了NSCs衍生的特定表型在慢性神經退行性疾病PD和急性神經退行性缺血性中風中的治療潛力。

帕金森病

帕金森病（PD）是一種進行性神經退行性疾病，病理特征是黑質緊密層的DA能神經元變性，隨后支配紋狀體的DA能軸突末梢丟失，導致運動障礙。

目前，PD的主要治療方法是多巴胺替代療法。然而，它只能緩解PD的癥狀而不能延緩PD的進展。關于體外靶向分化VM DAergic神經元的成功，一些研究已將這些細胞移植到不同的PD模型中，以觀察它們在行為、細胞和分子水平上的治療效果。

上述大多數(shù)研究將預分化的NSC植入6-OHDA或MPTP誘導的PD模型的紋狀體中，導致感覺運動改善，例如自發(fā)活動增加和轉圈行為減少。考慮到放置在黑質中的VM組織移植物無法將軸突延伸足夠長以到達其目標區(qū)域紋狀體以形成復雜的神經回路，因此考慮異位植入。植入后，其中一些經過預處理的NSC可以在PD動物模型中存活，并表現(xiàn)出黑質DAergic神經元的表型，多巴胺水平增加。

• 延申閱讀：拜耳表示神經元干細胞療法治療帕金森病：首個1期臨床試驗取得積極結果

因此，目前的研究表明，異位和同位移植的VMDA神經元都可以進行突觸前和突觸后整合，并且很自然地假設重建的功能性黑質-紋狀體回路導致PD模型中的運動恢復。

除了移植位置，DA能神經元分化的最佳移植時間窗對黑質-紋狀體回路的重建也很重要。以VM組織為供體，移植時供體細胞的成熟度顯著影響移植物的組成和功能結果。具體來說，在DA神經發(fā)生高峰期（胚胎第12天）之前分離的供體組織在移植物中產生更多的DA能神經元，這歸因于植入時DA神經母細胞存活和增殖增加。

缺血性中風

缺血性中風是一種嚴重的腦血管事件，雖然它不是一種神經退行性疾病，但它會導致梗死區(qū)域的病理性細胞死亡，包括不同類型的神經元和神經膠質細胞。

目前，缺血性中風的治療手段相對有限，主要包括血管內手術（血栓切除術）和靜脈注射阿替普酶（血栓溶解）以恢復血流。然而，這些治療方法存在一定的局限性，如治療窗窄、存在禁忌癥、療效低以及再灌注損傷等問題，導致只有少數(shù)患者能夠從中受益。

近年來，細胞替代療法在缺血性中風治療中顯示出潛力。一些研究針對缺血性中風中丟失的不同細胞類型，通過移植特定細胞來重建受損的神經回路。

• 例如，一項臨床和影像學研究顯示，卒中患者癥狀最嚴重時受損細胞的分布往往不在紋狀體中，這表明細胞替換策略應強調重建受損的皮質而不是紋狀體。研究將來自PSCs的具有皮質谷氨酸能表型的祖細胞植入缺血性卒中大鼠模型的皮質中，發(fā)現(xiàn)這些細胞在移植后可以減輕感覺運動障礙。

此外，移植細胞能夠從丘腦皮質接收突觸輸入，并能夠根據(jù)生理感覺刺激調節(jié)自身活動，表明功能回路重建是移植后晚期時間點運動功能恢復的原因。

除了感覺運動功能障礙外，大多數(shù)中風幸存者還患有認知障礙，這可能與少突膠質細胞死亡導致的腦白質脫髓鞘有關。

• 徐等人提出了一種兩步方案，可從iPSC中穩(wěn)定、快速地獲得NG2陽性OPC，將OPCs移植到缺血大鼠的腦室后發(fā)現(xiàn)，這些細胞可以通過抑制炎癥和免疫反應來保護宿主神經元在缺血環(huán)境下免于死亡。此外，這些細胞通過促進缺血性中風大鼠的髓鞘再生過程，在一定程度上挽救了學習和記憶喪失。

綜上所述，干細胞治療缺血性中風的研究進展顯示，基于干細胞的療法可以改善缺血性中風患者的神經功能缺陷和日常生活活動能力。這些研究為缺血性中風的治療提供了新的視角和潛在的治療策略。隨著臨床試驗的進行和科學研究的深入，未來可能會有更多有效的治療方法被開發(fā)出來，以改善患者的生活質量和預后。

討論和未來方向

根據(jù)您提供的背景信息和搜索結果，我們可以討論以下幾個關于神經退行性疾病治療和未來方向的關鍵點：

靶向分化方案的優(yōu)化：目前，外部培養(yǎng)系統(tǒng)正逐漸從最初的共培養(yǎng)或使用定義不明確的異種因子轉向完全化學定義和無異種因子的條件，這有利于建立更穩(wěn)健的分化方案。這意味著未來的研究將更加注重創(chuàng)建一個清晰和可控的環(huán)境，以促進神經干細胞（NSC）的定向分化。

形態(tài)發(fā)生素、生長因子和小分子的使用：進一步探索這些因子在濃度、順序和持續(xù)時間方面的使用對于優(yōu)化NSC的分化至關重要。這些因素對于實現(xiàn)分化細胞的充分成熟和長期表型的維持非常關鍵。

表觀遺傳機制的調控：越來越多的研究表明表觀遺傳機制可以調控神經分化中各種發(fā)育信號通路的激活和抑制之間的相互作用。例如，精細地調節(jié)遺傳程序以協(xié)調不同的神經譜系分化。

RNA干擾技術的應用：隨著RNA干擾技術的進展，它們也可以用于指導NSCs的靶向分化。

三維誘導和生物材料的應用：利用生物材料進行三維誘導以有效控制干細胞的命運越來越受到重視。

導電聚合物和電刺激的應用：導電聚合物已被證明可以在體外通過電刺激誘導神經干細胞定向分化。

移植細胞的病理性生長的解決策略：人們正在積極采取多種策略來解決各種來源的移植細胞可能出現(xiàn)的病理性生長，如利用細胞分選技術在移植前去除脫靶污染細胞類型或轉導配體激活的自殺基因以在體內消融增殖細胞。

誘導神經元（iN）技術的發(fā)展：直接對體細胞進行重編程以獲得功能性神經元已成為可能。然而，iN方法將體細胞直接轉化為非分裂神經元，而不是命運定向的神經元祖細胞，這些非分裂神經元移植后往往難以在宿主腦中存活，整合也較差。

細胞移植策略的個性化：在進行供體細胞移植前應充分考慮不同神經系統(tǒng)疾病所呈現(xiàn)的具體病理狀態(tài)，這可能在一定程度上影響細胞移植策略。

除了移植定向誘導的神經干細胞外，體內細胞重編程和神經膠質細胞原位轉化為功能性新神經元：這是一種很有前途的神經再生策略。

基因工程改造的干細胞：移植的外源性干細胞可以通過基因工程穩(wěn)定地產生生長因子，支持修復功能失調的內源性神經元。

臨床前研究和臨床試驗的進展：近期的臨床前研究已證明源自PSC的DAergic神經元的安全性和有效性。基于這些有希望的結果，不同國家正在進行臨床試驗。

這些方向展示了神經退行性疾病治療領域的廣泛研究和未來潛力，特別是在干細胞療法和基因編輯技術方面。隨著技術的不斷進步和臨床試驗的開展，我們有望在未來看到更多有效的治療方法被開發(fā)出來。

參考資料：Nie, L., Yao, D., Chen, S. et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9, 215 (2023). https://doi.org/10.1038/s41420-023-01532-9

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