在生物醫(yī)學飛速發(fā)展的當下，多能干細胞的研究為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了前所未有的曙光。其中，來自多能干細胞的神經(jīng)細胞藥物，正逐漸從實驗室的理論設(shè)想邁向臨床應用的現(xiàn)實。這一創(chuàng)新療法不僅有望重塑神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療格局，更可能為無數(shù)患者帶來新的希望。本文將深入探討這類神經(jīng)細胞藥物從研發(fā)構(gòu)思到臨床前評估的每一步歷程，剖析其背后復雜而精妙的科學進程。

1.有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的介紹

神經(jīng)系統(tǒng)是人類各種認知和運動功能的控制中心，神經(jīng)系統(tǒng)紊亂會導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來，神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為全球死亡和殘疾的一個重要原因，例如神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)損傷，2016年分別影響了900萬人和2.76億人。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(?CNS?)的自我修復能力有限，針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈方法仍然很少。

長期以來，細胞替代療法一直是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種非常有前景的方法。胎兒腦源性神經(jīng)干細胞 (NSC) 和腹側(cè)中腦 (VM) 組織分別在治療中風和帕金森病 (PD)?方面表現(xiàn)出積極作用。然而，由于倫理限制和細胞質(zhì)量的變化，胎兒組織的應用往往受到限制。人類多能干細胞 (hPSC)，包括人類胚胎干細胞 (hESC) 和人類誘導多能干細胞 (hiPSC)，由于其無限的自我更新能力和向所需外胚層細胞類型的多分化潛力，為移植提供了可行的神經(jīng)元細胞來源。到目前為止，幾種 hPSC 衍生的神經(jīng)元細胞類型已在神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中成功測試，并已證明其體內(nèi)安全性和有效性。一些國家還啟動了首次人體臨床研究。

不過，細胞衍生物制備和質(zhì)量評估挑戰(zhàn)重重，涉及細胞類型選擇、分化階段確定、動物模型構(gòu)建、質(zhì)量控制等多方面，這嚴重阻礙了干細胞臨床應用和商業(yè)化。

鑒于各國要求不同，監(jiān)管政策有差異。國際干細胞銀行計劃匯聚研究人員，發(fā)表系列文件，就多能干細胞臨床轉(zhuǎn)化達成全球共識，涵蓋質(zhì)量控制、倫理等方面，推動了轉(zhuǎn)化并保障細胞產(chǎn)品質(zhì)量安全，還與其他組織合作推進細胞藥物制造標準化。

將多能干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細胞藥物要經(jīng)過開發(fā)、生產(chǎn)和臨床前評估三大工序

在干細胞治療帕金森病領(lǐng)域，GForce-PD發(fā)揮國際協(xié)調(diào)作用。本文總結(jié)干細胞治療臨床前研究原則，為學術(shù)產(chǎn)品開發(fā)者提供指導，實際應用需遵循當?shù)胤ㄒ?guī)^[1]。

2.早期原則和產(chǎn)品開發(fā)

2.1 細胞獲取的倫理原則

• hESC和hiPSC依賴人類捐獻者，獲取捐獻者細胞需遵循國際公認原則（如ISSCR 2016指南）與當?shù)胤煞ㄒ?guī)。
• 每個細胞系必須有捐獻者 / 主治醫(yī)生簽署的知情同意書，以及醫(yī)院的倫理支持文件。
• 要告知捐獻者隱私保護的限制，以滿足安全性和可追溯性需求。

2.2 細胞供體的選擇

• 需對胚胎或細胞捐獻者進行仔細風險評估，篩查各類潛在人類傳染性病原體，如 HIV、HBV、HCV 等嚴重血源性病毒性疾病。
• 根據(jù)捐獻者選擇過程中的信息，考慮篩查其他生物體。
• 專業(yè)評估還應考量遺傳病。
• 建議收集捐獻者血液樣本的ABO血型、HLAI類和 II 類基因型信息，用于檢查衍生細胞系身份，以及匹配細胞系血液和組織類型，降低患者免疫反應。

2.3 適當?shù)纳窠?jīng)細胞類型

• 合適的細胞分化條件決定神經(jīng)元細胞多樣性，不同細胞表型特性和功能各異。
• 帕金森病由黑質(zhì)中腦多巴胺能神經(jīng)元（mDA）丟失引發(fā)，只有mDA細胞能在帕金森病模型中建立正確連接，獲得治療效果，前腦/后腦神經(jīng)元無效。
• 肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）特征為上下運動神經(jīng)元丟失，由反應性星形膠質(zhì)細胞毒性引起，除移植運動神經(jīng)元，移植健康星形膠質(zhì)細胞改善微環(huán)境也是有效治療方法。
• 腦損傷、中風和脊髓損傷等涉及多種神經(jīng)細胞功能喪失和微環(huán)境變化，使用單一神經(jīng)元細胞恢復連接有挑戰(zhàn)，神經(jīng)干細胞（NSC）能分化成神經(jīng)元且分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，是有前途的治療細胞類型。

2.4 移植細胞的階段

• 基于 hPSC 的神經(jīng)替代療法，移植階段的選擇很關(guān)鍵。
• 早期神經(jīng)祖細胞存活神經(jīng)元產(chǎn)量高，但有不受控制增殖風險；成熟神經(jīng)元移植后存活率差。
• 移植細胞的存活情況和動物模型行為改善可提示適當?shù)囊浦搽A段。需找出不同階段（增殖祖細胞、有絲分裂后神經(jīng)母細胞、成熟神經(jīng)元）的特定標志物。
• 帕金森病細胞治療研究中，早期有絲分裂后神經(jīng)元應用最廣泛；星形膠質(zhì)細胞移植中，譜系限制性祖細胞應用廣泛，但各制造階段最佳細胞表型仍待進一步研究。

3.細胞制造質(zhì)量控制的一般考慮因素

3.1 質(zhì)量管理體系

• 完善的質(zhì)量管理體系（QMS）對確保細胞庫運營和細胞生產(chǎn)的可靠輸出極為關(guān)鍵，建議遵循適用于許可產(chǎn)品的良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）。
• QMS 需針對制造產(chǎn)品，明確制造商責任、采用標準及所有制造程序摘要，涵蓋捐贈者樣本收集、原材料選擇等一系列操作程序與質(zhì)量文件。
• QMS 要保證從原材料到最終產(chǎn)品的所有材料和程序具有可追溯性，通常在質(zhì)量手冊中闡述一般程序、相關(guān)標準和政策。

3.2 細胞株存庫流程

• 制備臨床細胞產(chǎn)品的首要步驟是確保建立 hPSC 的供體適用性，保存生產(chǎn)細胞的早期庫存，選擇符合 GMP 標準的科學質(zhì)量控制和安全測試線。
• 依據(jù)適用標準選擇和鑒定試劑及材料，如 “無異種” 和化學成分明確的培養(yǎng)基等。
• 為減少不同批次細胞差異，建議采用包含主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）的多級細胞庫系統(tǒng)作為生產(chǎn)培養(yǎng)物供應起點。

3.3 hPSC 的質(zhì)量控制

• hPSC 作為起始材料，其質(zhì)量對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和可重復性意義重大。
• 需對細胞庫材料進行適當?shù)馁|(zhì)量控制檢測，包括細胞形態(tài)、活力、DNA 指紋等多項測試。
• hPSC 的批次間差異可能是工藝差異的主要來源，因此需開發(fā)大量同一批次的 hPSC 。

3.4 產(chǎn)品過程管理

• 整個生產(chǎn)過程中，必須嚴格把控細胞產(chǎn)品質(zhì)量。質(zhì)量管理體系應在關(guān)鍵步驟指明特定的質(zhì)量控制測試，如細胞標志物和微生物測試，以保證提供具有特定傳代水平的可重復細胞制劑。
• hPSC 衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)過程主要包括 hPSC 生產(chǎn)和神經(jīng)元細胞生產(chǎn)兩部分。hPSC 生產(chǎn)中，擴增時要進行過程測試以確保其保持內(nèi)在特性；神經(jīng)元細胞生產(chǎn)中，在分化過程的不同時間點進行多項質(zhì)量控制測試，文中圖1總結(jié)了當前通用的已發(fā)布工作流程。

3.5 移植細胞的純度

• hPSC 神經(jīng)替代療法的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是獲取高同質(zhì)性目標細胞類型。需明確最終細胞產(chǎn)品全部組成并清除殘留干細胞，因其有安全風險。
• 臨床證據(jù)顯示，污染的5-羥色胺神經(jīng)元可致PD患者移植物誘導的運動障礙，臨床前研究表明殘留祖細胞會在腦或脊髓中異常增殖或形成結(jié)構(gòu)。
• 部分研究團隊采用特定表面標志分選細胞、添加槲皮素等策略提高純度，且需驗證無未分化細胞。

3.6 細胞配制和保存

• 細胞作為“活藥物”，其生物過程持續(xù)進行且受環(huán)境影響，建立有效保存制度很關(guān)鍵。
• 細胞制劑分新鮮非冷凍和冷凍保存兩類。新鮮細胞活力和特性好但壽命短，不適合長期儲存和全面質(zhì)控；冷凍細胞保質(zhì)期長，可進行質(zhì)控和安全放行測試，但凍融有損傷等問題。
• 應選擇適合神經(jīng)元細胞的冷凍保存液，并驗證冷卻、解凍條件，且解凍后24小時細胞活力和恢復情況可準確反映冷凍效果，同時要按 ICH Q5C 指南研究細胞產(chǎn)品儲存和運輸穩(wěn)定性。

3.7 細胞產(chǎn)品放行測試

• 細胞產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性是體內(nèi)安全有效的前提，需對產(chǎn)品批次按預定比例測試。
• 評估系統(tǒng)包括生物污染、細胞活力等體外測試，應基于多批次數(shù)據(jù)制定放行測試公差。
• 基因組完整性檢測（如全基因組測序）有助于了解遺傳變異風險，但要明確基因變化與患者安全相關(guān)性，雖無統(tǒng)一基因組穩(wěn)定性標準，可參考已發(fā)表研究，選擇無癌癥相關(guān)基因大異常或非同義突變細胞有助于降低致瘤風險，但不能完全認證體內(nèi)安全性。

4. 臨床前體內(nèi)評估

4.1 細胞移植的部位

• 神經(jīng)元細胞移植旨在組織替代或提供局部營養(yǎng)，需將細胞遞送至目標部位。例如中風時在缺血半暗帶移植以拯救細胞和重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；ALS 最佳途徑是鞘內(nèi)注射；PD 治療可將細胞移植到背側(cè)紋狀體或黑質(zhì)。
• 嚙齒動物一到兩個部位移植可實現(xiàn)神經(jīng)支配，靈長類動物大腦較大，為實現(xiàn)足夠神經(jīng)支配，PD 臨床研究中每個半球常需三到八個注射道，非人靈長類動物在移植策略評估上因大腦與人類相似具有優(yōu)勢，小動物移植策略不足以模擬人類治療。

4.2 毒性試驗及劑量耐受性

• 界定細胞毒性和劑量耐受性對新藥至關(guān)重要。毒性測試應遵循臨床途徑，研究對靶器官及肝臟、心臟、腎臟等非靶器官的毒性作用。
• 高劑量細胞給藥安全風險更大，動物實驗中設(shè)置不同劑量組確定最大可行劑量可為臨床研究提供支持，當細胞在體內(nèi)可能增殖時，劑量確定更具挑戰(zhàn)性，大鼠或小鼠腦內(nèi)和脊髓接受細胞數(shù)量有一定范圍。

4.3 過度生長和致瘤性檢測

• hPSC 衍生細胞安全性需考慮不受控制的增殖和腫瘤形成。過度細胞生長會影響宿主細胞網(wǎng)絡(luò)和功能，要通過對足夠數(shù)量動物進行組織病理學和免疫組織化學分析研究移植物體積和增殖標志物，移植物體積與移植細胞性質(zhì)有關(guān)，如較年輕或分化程度低的細胞擴增更廣泛，純化神經(jīng)元制劑細胞損失和移植物尺寸減小。
• 要區(qū)分致癌性（宿主正常細胞受刺激形成腫瘤）和致瘤性（與移植細胞有關(guān)），為確定未分化 hPSC 污染情況，一些研究小組進行加標研究。

4.4 體內(nèi)存活和分布

• 神經(jīng)細胞移植期望在宿主體內(nèi)長期存活以替代丟失細胞，但因細胞消化、機械損傷和微環(huán)境改變等，大量移植細胞會死亡，移植 DA 存活率低，移植后第一周對細胞存活很關(guān)鍵，抑制 p53、改變聚唾液酸表達或注射 GDNF 有助于提高細胞存活率。
• 雖神經(jīng)元細胞長距離遷移證據(jù)少，但需證明注射后細胞分布，非侵入性細胞追蹤方法可用于監(jiān)測動物，避免多個時間點處死動物。

4.5 體內(nèi)細胞命運

• 移植的神經(jīng)元細胞多由 NSC 和未成熟祖細胞組成，需在體內(nèi)進一步分化成熟。體外分化技術(shù)可靠，但體內(nèi)復雜微環(huán)境會影響細胞命運造成異質(zhì)性，單細胞 RNA 測序顯示移植的多巴胺能祖細胞可產(chǎn)生多種細胞類型，不同 NSC 系在脊髓產(chǎn)生神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的比例不同，因此確認細胞產(chǎn)物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為所需細胞類型及是否存在危險細胞類型很重要。

4.6 細胞功效評估

• 動物模型療效評估是臨床試驗的先決條件，理想動物模型應再現(xiàn)患者病理病變和行為癥狀。小鼠和大鼠模型因易獲取和成本低常用于療效測試，非人靈長類動物模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中更具優(yōu)勢，更能準確預測人類細胞劑量效應和療效。
• 應開發(fā)和使用有效的行為評估方法和標準證明細胞產(chǎn)品功效，功能終點包括細胞支配、神經(jīng)回路重建等方面研究，有助于理解作用機制，鼓勵研究人員發(fā)表臨床前結(jié)果以進行嚴格驗證，多項使用 hPSC 衍生神經(jīng)元細胞的臨床研究正在進行。

5. 挑戰(zhàn)與未來前景

5.1 即用型冷凍保存格式

• 細胞冷凍保存的發(fā)展為細胞替代療法創(chuàng)造了條件，但有效細胞產(chǎn)品面臨配方開發(fā)難題。當前多數(shù)冷凍產(chǎn)品輸注前需解凍后清洗、濃縮以去除 DMSO 等賦形劑，這一額外處理增加安全風險，還可能損害細胞穩(wěn)定性。
• 未來配方開發(fā)的主要方向是研發(fā)含更少賦形劑、更簡單（甚至不含 DMSO）的冷凍保存溶液，實現(xiàn)無需額外操作或僅簡單稀釋的即用型神經(jīng)元細胞產(chǎn)品。甘油等其他冷凍保護劑可作為替代選擇，且地松鼠 iPSC 衍生神經(jīng)元獨特的抗寒途徑，為促進神經(jīng)元細胞臨床應用帶來潛力。

5.2 功能檢測的替代標記

• 預測神經(jīng)成熟和體內(nèi)結(jié)果是細胞置換面臨的挑戰(zhàn)。移植神經(jīng)元細胞成熟與整合耗時數(shù)月，功能評估需大量時間和動物。
• 鑒定替代標志物能顯著提升細胞質(zhì)量和研究效率，為產(chǎn)品效力測定及放行測試提供基礎(chǔ)。Parmar 團隊通過 RNA-Seq 明確多巴胺能祖細胞基因表達與體內(nèi)結(jié)果的關(guān)系，確定了相關(guān)標志物，推動了該領(lǐng)域進展。后續(xù)有望發(fā)現(xiàn)更多此類生物標志物，但需投入驗證工作。

5.3 低免疫原性細胞產(chǎn)品

• 免疫排斥是細胞替代療法的關(guān)鍵問題，多數(shù)試驗采用同種異體細胞產(chǎn)品，而神經(jīng)元細胞替代療法需植入細胞長期存活。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)有免疫特權(quán)，但同種異體細胞在大腦中的免疫排斥仍存在。
• 傳統(tǒng)克服方法是使用免疫抑制藥物，但其有副作用，會增加感染和腫瘤形成風險，對老年患者（退行性疾病治療的關(guān)鍵人群）威脅更大。
• 生成通用相容細胞是可行途徑。一是通過基因編輯使 hPSC 的 HLA 沉默，該策略已在體外和體內(nèi)證實可靠，但此類工程通用神經(jīng)元細胞的應用尚未見報道；二是收集含多種 HLA 類型或單倍型的 hPSC 系，已在非人類靈長類動物中驗證并在臨床研究中嘗試。不過這兩種方法各有利弊，臨床應用前需獲取細胞安全性和低免疫原性的有力證據(jù)。

總結(jié)來說，hPSC衍生神經(jīng)細胞臨床研究雖進展迅速，但面臨諸多挑戰(zhàn)，需深入研究以提升神經(jīng)細胞產(chǎn)品的安全性與有效性，尤其是關(guān)注潛在致瘤性和功能效力測定方面 。

參考資料：Sun Y, Feng L, Liang L, Stacey GN, Wang C, Wang Y, Hu B. Neuronal cell-based medicines from pluripotent stem cells: Development, production, and preclinical assessment. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S31-S40. doi: 10.1002/sctm.20-0522. PMID: 34724724; PMCID: PMC8560198.

免責說明：本文僅用于傳播科普知識，分享行業(yè)觀點，不構(gòu)成任何臨床診斷建議！杭吉干細胞所發(fā)布的信息不能替代醫(yī)生或藥劑師的專業(yè)建議。如有版權(quán)等疑問，請隨時聯(lián)系我。