間充質干細胞治療糖尿病的潛力

• 文章概述：間充質干細胞 (MSC) 是自我更新的多能細胞，能夠分泌多種生物因子，恢復和修復受損組織。臨床前和臨床證據證實了MSCs在各種醫療條件下的治療益處。目前，MSCs是臨床試驗中最常用的基于細胞的療法，因為它們具有再生作用、易于分離和低免疫原性。實驗和臨床研究已經提供了使用MSCs治療糖尿病的有希望的結果。這篇綜述將總結MSCs在組織修復中的作用，提供改善MSC功能的新興策略，并描述這些過程如何轉化為糖尿病的臨床治療。

介紹

干細胞生物學的進步見證了一個令人興奮的新研究領域的興起，即再生醫學。再生醫學是轉化研究的多學科分支，旨在修復受損組織以恢復正常的細胞功能。迄今為止，臨床試驗中最常研究的細胞群包括間充質干細胞/基質細胞 (MSC)。間充質干細胞的治療潛力基于它們易于分離、分化成多種細胞類型的能力、低免疫原性以及最重要的是它們釋放的生物因子顯示可以減輕受損組織。

MSC是起源于中胚層的多能細胞，其特征是：(i) 粘附塑料并自我更新，(ii) 表達特定的表面抗原標記（CD73、CD90、CD105），以及 (iii) 至少具有以下能力：分化成骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞。

MSC在體內廣泛分布，因此可以從多種來源分離，包括骨髓、心臟、體液、皮膚和圍產期組織。MSC通過釋放已知可再生受損細胞和組織的免疫調節和營養因子來對微環境變化（pH值、氧氣、壓力）做出反應。神經退行性和心血管疾病的實驗結果支持了基于細胞的研究的快速發展。迄今為止，美國有695項臨床試驗正在測試MSC作為一系列醫學病癥的治療劑的效用。

本綜述的目的是對現有文獻進行簡要總結，評估MSCs作為糖尿病的新型治療藥物。此外，這篇重點綜述將討論最近用于增強干細胞性能的方法，以及這些發現如何轉化為內分泌研究。

間充質干細胞的可用和可再生資源

2012年，山中伸彌因發現成熟細胞可以重編程為多能細胞而成為諾貝爾生理學或醫學獎的獲得者之一。這種非凡的技術是一種優秀且易于獲得的自體干細胞來源，可克服細胞/組織排斥問題。骨髓和脂肪組織是 MSC的另一個來源，但它們的缺點是需要侵入性儀器來收集組織。

一種以非侵入性、道德上合理的方式回收MSC的新興方法，傳統上被認為是醫療廢物，包括胎盤和/或臍帶。此外，與其他MSC組織來源相比，來自這些新生組織的細胞被假定具有更高的增殖和分化能力，以及更高的表達旁分泌因子的能力。在美國，疾病控制和預防中心每年大約有400萬例出生和250萬例死亡，這導致圍產期組織中的MSCs過剩。

從人臍帶中分離間充質干細胞

研究表明，可以從臍帶血和沃頓氏膠（臍帶基質）中分離、擴增和冷凍保存MSC。然而，從沃頓氏果凍 (WJ) 中分離MSC的優勢包括：更高的產量、更同質的干細胞群、增加成功分離MSC的可能性以及更好的分化為胰島素生成細胞的能力。已經描述了幾種用于分離WJ-MSC的技術，但是兩種最常見的方法包括臍帶組織的酶消化或外植體培養方法（圖1）。

酶解法

在這種方法中，臍帶WJ組織暴露于破壞膠原蛋白基質的酶，從而將細胞釋放到下面的溶液中。然后將溶液收集到錐形管中，離心以將沉淀（細胞）與懸浮液分離。去除上清液并將細胞接種在具有干細胞培養基的組織培養皿中。膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶和分散酶是用于從基質中分離WJ-MSC的酶的例子。

外植法

這種方法下的MSC的衍生依賴于將解剖的臍帶組織碎片直接轉移到組織培養皿上。培養皿中充滿了刺激干細胞繁殖的培養基。WJ臍帶組織與培養皿底部的粘附允許干細胞從臍帶遷移到培養皿的表面。在第一周內，細胞明顯粘附在塑料培養皿的表面，此時可以去除組織。

雖然這種技術很簡單并且對臍帶組織的操作較少，但許多研究人員認為，與酶促方法相比，這種方案會導致細胞達到匯合的時間更長。

間充質干細胞的流式細胞術表征

在37°C、5%CO₂的加濕培養箱中使用干細胞培養基培養細胞后，國際細胞治療協會指出，細胞必須表達特定的細胞表面抗原標記才能滿足MSC的定義。來自臍帶的間充質細胞應表達CD73、CD90和CD105的 ≥95%。此外，MSC應表達CD14或CD11b、CD34、CD45、CD19或CD79α或HLA-DR的≤2% ，因為它們是造血分化的標志物。

將間充質干細胞分化為脂肪、骨骼和軟骨

MSCs因其多向分化潛力而被理想化，并已被證明能夠持續分化為至少三種專門的細胞類型——軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞。

其他文章報道了MSC成功分化為產生胰島素的細胞、雪旺細胞和神經元。圖2描繪了一個WJ-MSC，它粘附在塑料上，表達MSC表面抗原，它也已經分化成三種細胞類型。

(A) 人臍帶的橫截面。(B) WJ-MSCs成纖維細胞樣外觀的塑料粘附。放大10 倍。(C) WJ-MSC表面抗原標記物的流式細胞術。(D) WJ-MSC多向分化為 (a) 成骨細胞（茜素紅染色），(b) 成脂細胞（油紅O染色）和 (c) 軟骨形成細胞（阿爾新藍）。放大10倍。

間充質干細胞刺激組織修復

眾所周知，MSCs的有益結果是通過生物因子的旁分泌釋放而不是將細胞植入受體組織中產生的。出于本次審查的目的，檢查MSCs再生特性的研究將歸納為以下主要主題：血管發育、抗炎和抗纖維化（圖3）。

血管發育

血管生成，即新血管的形成，是組織傷口愈合的重要過程，許多藥物都將其作為治療心肌缺血、缺血性中風和糖尿病性視網膜病變等疾病的目標。心臟和腦缺血的臨床前研究支持MSCs通過修復和刺激血管生長改善結構和功能結果的概念。

MSCs的血管生成特性是通過釋放缺氧誘導因子、血管內皮生長因子、血管生成素和促紅細胞生成素來介導的。糖尿病周圍血管疾病、皮膚傷口修復和骨壞死的研究支持了 MSCs 給藥后修復血管損傷的能力。

免疫調節

盡管炎癥是身體對有害刺激的自然反應，但過度或長時間的炎癥應激可能對細胞和組織有害。例如，慢性炎癥現已成為代謝綜合征發病的重要因素。因此，研究人員已開始探索炎癥與MSC治療之間的相互作用。特別是，MSC調節關鍵的炎癥細胞類型，包括T細胞、自然殺傷細胞、B細胞和樹突狀細胞。MSC與這些先天性和適應性免疫細胞的相互作用導致炎癥標志物。用MSCs治療的骨退化研究也強調了它們減少巨噬細胞炎癥蛋白和單核細胞趨化蛋白分泌的能力。

抗纖維化

多個小組已經記錄了MSC的抗纖維化作用。在一項針對Sprague-Dawley大鼠輻射誘導的肺纖維化的研究中，Dong及其同事表明，在系統性MSC滴注后，促纖維化轉化生長因子-β和腫瘤壞死因子-α有所減少。作者推測MSCs還通過分泌肝細胞生長因子和前列腺素來抑制肺纖維化。

總而言之，越來越多的文獻證明了MSCs可能在內分泌失調中提供的潛在益處。

增強間充質干細胞存活和功能的策略

為了對受損細胞提供再生作用，移植的 MSC 必須首先在處理組織的惡劣環境中存活下來。在這個利基市場中，MSCs必須克服各種壓力源，包括缺氧、炎癥、高酸度和能量儲備減少。延長MSCs存活時間的策略足以提供豐富的恢復因子來源，包括：(i) 預處理細胞（缺氧、機械刺激），(ii) 對MSCs進行基因修飾（用啟動子靶向小發夾RNA進行病毒轉染以過度表達/沉默特定蛋白質）和（iii）使用生物材料（支架、水凝膠）遞送MSC。

缺氧預處理

心肌梗死的臨床前研究表明，心內注射缺氧處理的干細胞可維持周圍心肌細胞的活力，保留心臟功能，并且細胞植入受損心臟的能力更高。

血管內皮生長因子（遺傳）過度表達

在大鼠心肌梗死模型中，通過轉染病毒載體過度表達血管內皮生長因子 (VEGF)，保護MSCs免于細胞死亡，刺激血管生長，改善心臟功能并縮小梗塞面積。使用糖尿病小鼠模型，用經病毒轉導表達VEGF的MSC處理的胰島移植物顯示出較低的血糖、手術后更快恢復正常血糖并改善移植物血管形成。

間充質干細胞治療糖尿病

MSCs的多功能特性已經引起了他們作為糖尿病療法的臨床興趣。迄今為止，已有40多項臨床試驗注冊使用MSCs作為糖尿病治療劑。這些研究的范圍從糖尿病相關的血管并發癥到傷口愈合，甚至包括用于治療新發診斷的MSC療法。截至2023年5月12日，142項MSC糖尿病研究已在clinicaltrials.gov上注冊。在這里，我們將總結臨床調查的結果，這些調查涉及使用間充質干細胞療法治療新發糖尿病和慢性糖尿病。

糖尿病

2015年，來自瑞典的研究人員 (Nbib1068951) 報告了第一項旨在評估自體MSC治療新診斷1型糖尿病患者的安全性和有效性的研究。從患者的髂嵴骨髓中采集干細胞，中位全身單次劑量為2.75×10⁶個細胞/kg。他們得出結論，MSCs的施用并未導致10名患者中的任何一名發生不良事件，并且在1年的隨訪中提供了有希望的C肽濃度。該I期試驗未顯示對照組和MSC組在血紅蛋白A1c (HbA1c) 或胰島素劑量方面存在任何功能差異。

Hu及其同事進行了一項單中心、雙盲研究，以檢驗臍帶沃頓膠質來源的MSCs對新發I型糖尿病患者的安全性、可行性和初步結果（Hu等人，2013年）。MSC治療組經歷了兩次靜脈輸注（平均細胞計數為2.6×10⁷），間隔4周。在MSC輸注后9至24個月，實驗組的餐后血糖和HbA1c測量值較低。此外，MSC組的胰島素使用和空腹C肽顯著改善。研究作者得出結論，在他們的小型研究中，臍帶間充質干細胞移植是可行且安全的，無法檢測功能差異。

在中國對患有長期2型糖尿病的患者進行胎盤來源的MSCs的初步研究表明，移植是安全、簡單且可能有效的（Jiang等人，2011年）。該調查包括10名病程≥3年、胰島素依賴（≥0.7U/kg/天）至少1年且血糖控制不佳的2型糖尿病患者。受試者平均收到1.35×10⁶/kg胎盤干細胞在三個不同的場合，靜脈輸注之間間隔1個月。治療六個月后，所有患者的胰島素劑量和HbA1c測量均顯示出改善的趨勢。此外，MSC治療后C肽和胰島素釋放也更高。此外，這項研究包括一組更接近實際臨床情況的個體，因為他們還患有其他合并癥，包括心臟病、腎臟疾病和血管并發癥。

最近，研究人員已經開發出分泌胰島素的MSC，并將它們與造血干細胞聯合輸送給I型糖尿病患者（Vanikar等人2010 年，Thakkar等人2015 年）。與同種異體移植相比，通過胰腺內途徑進行的自體移植往往在15-24個月時具有改善的C肽和餐后血糖。兩項研究都將干細胞管理視為具有潛在益處的安全程序；然而，需要進行更大規模的研究來證實他們的發現。

表1總結了利用間充質干細胞治療糖尿病的臨床試驗列表。

作者、年份、MSC 樣本量、國家	客觀的	納入標準	源碼	MSC劑量和遞送	結果
蔡等(2016) n=21中國1年	研究聯合UC-MSC和自體骨髓單核細胞移植（無需免疫治療）對確定的T1D患者的代謝控制和安全性的潛在益處	– 18–40歲 – 男女 – T1D病史≥2年和≤16年 – HbA1c≥7.5% &≤10.5% – 空腹血清C肽 <0.1pmol/mL – 每日胰島素需求量<100IU	來自單月新生兒的臍帶沃頓氏膠質來源的MSC+來自髂嵴的自體骨髓單個核細胞	UC-MSCs (1 × 10 6 /kg) BM-MNCs (107 × 10 6 /kg) 胰內	MSC隊列中無嚴重不良事件 1例伴短暫性腹痛； 1例穿刺部位出血 MSC組自我報告低血糖事件較少MSC組 C肽AUC提高106%，而對照組降低8%MSC組 血清胰島素AUC提高 49%，對照組降低6% HbA1c、FBG、胰島素劑量水平在第 3、6、9 和12個月時下降，而在對照組中它們保持穩定
胡等(2016) n=31中國3年	探索 WJ-MSCs 輸注對T2DM患者的長期安全性和有效性，隨訪期為36個月	– 18-60 歲患有 T2DM – 男女皆宜 – 根據ADA進行糖尿病診斷	來自單月新生兒的臍帶沃頓氏果凍來源的 MSC –	兩次靜脈輸注間隔1個月 每次輸注劑量：1×10 6 /kg	沒有發現嚴重的不良反應，包括：發熱、寒戰、肝毒性、超敏反應、感染、出血、蛋白尿、心肌梗塞或血栓栓塞事件,沒有患者出現嚴重的低血糖在MSC組中觀察到C肽和胰島素劑量的改善,輕微有益于 HbA1c和空腹血糖
斯凱勒等人。(2015) n=45美國12周研究	評估成人同種異體骨髓來源的間充質前體細胞在 T2D 中的安全性、耐受性和可行性，單獨使用二甲雙胍或與一種額外的口服抗糖尿病藥物一起控制不當	– <80歲患有 T2D – HbA1≥7.0% 至 <10.5% – 單獨使用二甲雙胍或與其他口服 降糖藥（噻唑烷二酮除外）聯合使用至少 3 個月 同意在整個研究期間使用避孕措施符合條件	骨髓來源的間充質前體細胞	0.3×106 /kg ( n ?=15) 1×106 /kg ( n=15) 2×106/kg ( n=15) 靜脈	MSC組和安慰劑組之間的治療緊急不良事件具有可比性 MSC組有1名受試者出現嚴重腹痛 在12周的研究中沒有出現嚴重不良事件MSC組沒有停藥或嚴重低血糖事件 實驗組對MSC沒有免疫反應
( Carlsson et al. 2015) n=9瑞典1年研究	評估自體間充質干細胞治療近期診斷為1型糖尿病患者的安全性和有效性	–18-40歲患有 T1D–在入組前不到3周診斷，并且受刺激的C肽水平 >0.1nmol/L	髂嵴自體骨髓單個核細胞	中位數2.75×106 個細胞/kg靜脈內	MSC組耐受無副作用的移植在任何研究中均未診斷出腫瘤或慢性感染,在MSC組中，所有研究患者均未發生高血糖酮癥酸中毒C肽值的AUC（進餐耐受性測試后）保留/增加
( Dave et al. 2015) n = 10India3年研究	描述體外MSC分化的胰島素分泌細胞與造血干細胞共輸注治療IDDM的經驗	– 8-45 歲患有 IDDM – 任何性別 – 診斷至少6個月，血清C肽水平低 (<0.5 ng/mL)	自體脂肪組織 MSC 分化為胰島素分泌細胞 + 自體骨髓來源的 HSC	自體：2.7 × 10 4 /kg 分泌胰島素的 MSC 同種異體：脂肪 MSCs-2.1 × 10 4 /kg 分泌胰島素的 MSC， 注入門脈循環、胸腺和皮下組織	干細胞輸注沒有不良影響所有患者的C肽、Hb1Ac、血糖狀態和外源性胰島素需求均得到改善 患者恢復了正常的生活方式和不受限制的飲食
( Thakkar et al. 2015 ) n=20（10個自體；10個同種異體）印度2年研究	評估自體與同種異體干細胞移植的安全性和有效性	– 8-45歲患有 T1DM–診斷時間>12個月–存在谷氨酸脫羧酶 (GAD) 抗體–低血清C肽	自體組：腹部脂肪MSCs 和骨髓HSCs 同種異體組：非糖尿病腹部脂肪 MSCs和骨髓 HSCs	自體2.7×104 /kg 分泌胰島素的 MSC 同種異體：脂肪 MSCs-2.1×104 /kg 分泌胰島素的 MSC，注入門脈循環、胸腺和腹部皮下組織	無不良影響、發病率或死亡率平均胰島素需求、血清C肽、平均 HbA1c持續改善
( Hu et al. 2013) n=15中國2年研究	評估WJ-MSCs 對新發T1DM的長期影響	–根據ADA≤6個月且空腹C肽≥0.3 ng/mL的T1DM≤ 25歲的男女患者	新生兒臍帶沃頓氏膠質干細胞	2.6×107個細胞 靜脈內	無明顯不良反應 對照組與實驗組空腹血糖無差異9個月后，MSC組HbA1c、胰島素用量、C肽均有改善
瓦尼卡等人。(2010) n =11印度1年學習	目前通過共移植分泌胰島素的脂肪來源的 MSC 和骨髓 HSC 進行胰島素替代療法的研究結果	– 5-45歲患有 IDDM至少6個月 – 任何性別 – 血清C肽水平低 (<0.5ng/mL)	脂肪組織和骨髓來源的 MSC 和 HSC，分別	移植的平均總細胞量為96mLs，培養的骨髓有核細胞計數：平均值為 28×10 3/μL和 MSC-1.2×103 /μL	無與干細胞輸注或誘導治療相關的不良/不利副作用任何患者均無DKA
劉等人。(2014) n=22中國1年學習	探索WJ-MSC移植治療T2DM患者的療效和安全性，治療后隨訪12個月	– 根據ADA標準，患有T2DM的18-70歲 –任何性別，未懷孕或哺乳 – 最近抗糖尿病治療（包括至少3個月的藥物和/或胰島素注射）血糖控制不佳 – 谷氨酸脫羧酶抗體陰性 –空腹血糖水平≥7.0mmol/L和 HbA1c≥7% – 有機充足：心臟、肝臟、腎臟和肺	來自足月新生兒的臍帶沃頓氏膠質衍生 MSC	第一次移植：靜脈內 第二次移植：胰內 每次輸注劑量：1×10 6 個細胞/kg	3 名患者在手術后第 1 天發熱 1名患者出現皮下血腫 1名患者出現惡心、嘔吐和頭痛 HbA1c、胰島素用量和空腹C肽輕度改善 全身炎癥標志物在6個月時減少
( Jiang et al. 2011 ) n ?= 10 中國	評估胎盤來源的 MSCs 在 T2DM 中的安全性和臨床可行性	–30-85歲患有 T2DM – 糖尿病病程≥3 年 –需要胰島素以 ≥0.7 U/kg/天的劑量達到最佳血糖控制至少 1 年	胎盤來源的間充質干細胞	平均總量1.35 × 10 6 /kg 間隔1個月的三次靜脈輸注	細胞移植后未觀察到全身表現 6個月時，治療后平均胰島素用量、C 肽和 HbA1c 有所改善

哪些糖尿病患者會受益于間充質干細胞治療？

鑒于El-Badawy和El-Badri的薈萃分析結果，I型和II型糖尿病患者可以從MSC治療中獲益 (?El-Badawy & El-Badri 2016)。此外，作者還討論了處于糖尿病早期階段的患者可能是干細胞治療的最佳人選。盡管本綜述納入了22項研究，但只有6項研究（共112名患者）使用了MSC，其中只有2項研究側重于早發性診斷（共 49名患者）。盡管如此，這四項針對慢性I/II型糖尿病患者（平均病程8年）的研究在糖尿病測量方面有所改善，這有力地證明了進一步研究以明確描述可能受益于MSC治療的潛在糖尿病人群是合理的。

臨床應用前對基于細胞的產品的監管

迄今為止，尚無用于分離、表征、擴增、效力測試或MSC病原體篩選的標準化方法。美國食品和藥物管理局 (FDA) 對基于細胞的產品的監管側重于三個主要主題：(i) 預防通過受污染的組織傳播傳染病，(ii) 正確處理和加工組織，以及 (iii) 證明細胞的臨床安全性和有效性，尤其是經過大量操作后。FDA還要求組織加工設施注冊、列出其產品并提供準確的產品標簽。

臍帶間充質干細胞的維護

公共和私人生物庫已經牢固地建立起來，用于冷凍保存來自臍帶血的造血干細胞。私人銀行最近提供了一種冷凍保存臍帶組織和臍帶血間充質干細胞的選擇。

然而，儲存MSC的成本可能成為一個問題，因為收集、處理和保存的初始費用在1000到3000美元之間?此外，銀行中心每年收取數百美元的存儲費用。來自拉夫堡大學的研究人員對同種異體誘導的多能干細胞衍生的β細胞療法進行了一項具有啟發性的成本效益分析。假設干細胞治療的成本約為200,000美元，計算得出在有/無免疫抑制治療的情況下實現成本效益（與胰島素治療相比）所需的移植物/移植生存期在8到11年之間。然而，目前的證據表明，移植物β細胞功能維持8-11年的可能性極小。一種更具成本效益的方法可能需要臍帶血來源的間充質干細胞給藥。

間充質干細胞的同種異體移植

MSC同種異體管理的優勢包括：(i) 廣泛可用性，(ii) 低成本 (iii) 和質量控制。雖然MSCs可以減少移植物抗宿主病的臨床后遺癥，但一些研究質疑同種異體移植物的安全性。例如，在同種異體皮膚移植大鼠模型中輸注供體MSC可誘導免疫原性反應（更高的TNF-α水平）。在Seifert的動物研究中，用同種異體MSCs 預處理實體器官移植導致更高的炎癥水平和排斥跡象的趨勢。

盡管在臨床前環境中有這些發現，但I期臨床試驗尚未報告MSC同種異體移植后的排斥/嚴重免疫反應。更大規模和長期的人體研究將需要評估供體來源的 MSC繼發排斥和/或炎癥的風險。

未來目標

在臨床醫學廣泛使用MSCs（或其衍生物）之前，許多未解決的問題仍然存在：

闡明內源性干細胞、外源性干細胞及其對微環境的反應之間的相互作用對于釋放MSCs作為內分泌疾病治療劑的潛在用途至關重要。

結論

鑒于它們具有減輕纖維化、調節炎癥和促進血管生長的能力，MSC為內分泌失調患者提供了一種有前途的治療策略。來自各種組織和器官的MSC的無限可用性及其有益特性加強了這些細胞類型在再生研究中的廣泛使用。

參考資料：Moreira, A., Kahlenberg, S., & Hornsby, P. (2017). Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for diabetes,?Journal of Molecular Endocrinology,?59(3), R109-R120. Retrieved May 12, 2023, from?https://doi.org/10.1530/JME-17-0117

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