人羊膜上皮細胞(hAEC)因具有低免疫原性、免疫調節、旁分泌作用、在體內不形成畸胎瘤等特性,在許多疾病的研究中顯示出良好的治療效果。

作用堪比全能干細胞，重新認識人羊膜上皮細胞的細胞特性及其治療應用

簡介：人羊膜上皮細胞 (hAEC) 來源于受精后第8天左右從外胚層分化而來的羊膜外胚層。羊膜外胚層的細胞形態和轉錄組與外胚層有明顯不同。隨著分化和擴增，羊膜外胚層逐漸與外胚層分離，形成充滿羊水的羊膜腔，此結構稱為羊膜囊。

羊水發生發生在原條形成之前，原條形成是原腸胚形成起始的標志，這使得羊膜外胚層細胞成為原始的胚外細胞之一。hAEC緊密堆積為單層，位于羊膜的最內層，直接與羊水接觸。

據報道，從妊娠早期羊膜中分離的hAEC表達TRA1-60、TRA1-81、SSEA3和SSEA4等多能性標志，這些標志在妊娠期間逐漸丟失。盡管許多臨床研究表明hAEC在多種疾病的治療中具有良好的潛力，但其具體的細胞生物學特征和治療機制仍然不清楚。

此外，研究表明hAEC缺乏端粒酶活性，增殖能力有限，阻礙了其作為細胞產品在臨床上的大規模應用和進一步的產業化。為了解決這些問題，全面了解hAEC至關重要，包括細胞特性、內在增殖能力和治療潛力。

01人羊膜上皮細胞的來源

人羊膜上皮細胞（hAECs）的來源可以總結如下：

• 胚胎內細胞團分化：hAECs源自胚胎內細胞團分化發育而成。這些細胞位于胎盤羊膜的最內層，由受精卵發育至第8天的囊胚內的細胞團分化而來。
• 羊膜的構成：人羊膜是附著在胎盤胎兒面的半透明無血管薄膜，由5層結構組成，包括上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層（后三層統稱為基質層），其中上皮層即為hAECs所在的層。
• 囊胚期上胚層分化：hAECs由胚胎發育第8-9天的囊胚期上胚層分化而來，其原始祖性僅次于源自內細胞團的胚胎干細胞。

• 羊膜腔的形成：在囊胚植入子宮內膜間質后，內細胞團分化為兩層：上胚層和下胚層。上胚層是三個胚層的起源，最終將分化為胚胎。隨后，內細胞團和鄰近滋養層細胞之間逐漸形成一空腔，即羊膜腔。位于羊膜腔內的細胞被稱為羊膜母細胞，即hAECs的前體細胞。

羊膜外胚層被認為是原始羊膜上皮細胞，在植入前后由外胚層分化而來。隨后，原條將從非羊膜起源的外胚層衍生而來，這代表三個胚胎胚層和器官發生的開始（圖1A）。

（A）受精卵經歷快速分裂。在桑葚胚階段，細胞表現出不同的分裂速度，導致形成內細胞團 (ICM) 和滋養外胚層。

（B）人羊膜由5層組成：1）上皮單層，2）基底膜層，3）致密層，4）成纖維細胞層和5）海綿層。

羊膜是一種重要的胚胎外組織，是動物從水生環境進化到陸生環境的重要里程碑。羊膜為胎兒提供機械保護，并分泌細胞因子和激素，促進胚胎發育。

羊膜上皮細胞分泌的蛋白質，如糖蛋白和膠原，構成了底層基底膜。羊膜上皮細胞和羊膜間質細胞主要分別位于上皮細胞層和成纖維細胞層。這兩種細胞有不同的來源。羊膜上皮細胞來源于羊膜外胚層，而羊膜間充質細胞則來源于胚外中胚層，后者發育在羊膜上皮細胞之后。作為源自羊膜的兩種主要細胞類型，這兩種細胞都具有免疫原性低、不致瘤、倫理考慮有限等優點。

表1列出了hAECs和人羊膜間充質干細胞（hAMSCs）的特征標記。

02人羊膜上皮細胞的特點

人羊膜上皮細胞（hAECs）具有以下特點：

• 多能性：hAECs具有表達多種胚胎干細胞標記物的特點和較全面的多向分化潛能，能夠向三胚層分化。

• 免疫調節性：hAECs具有免疫調節作用，可以分泌多種免疫調節因子，移植后不易產生免疫排斥反應。

• 無致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，這決定了其在體外擴增不超過6代，避免了干細胞臨床應用的致瘤性。

• 低免疫原性：hAECs具有低免疫原性，不表達MHC II類抗原和共刺激分子，減少了免疫排斥反應的發生。

• 神經細胞特性：hAECs能合成和分泌多巴胺，表達多巴胺受體D1和D2，以及多巴胺轉運蛋白，能分泌神經營養因子(如BDNF、NT-3、NGF等)和其他神經遞質與調質，具有向神經細胞分化的潛能。

• 分泌多種因子：hAECs能分泌多種神經遞質和神經營養因子，促使宿主自身干細胞功能的活躍及自身修復。

• 抗氧化自由基能力：hAECs內含有多種分化酶，提高人體抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等。

• 易于獲取且無倫理爭議：hAECs來源于胎盤，胎盤通常在分娩后作為醫療廢棄物丟棄，容易獲得，不涉及倫理問題。

• 促進血管生成和傷口愈合：hAECs具有調節血管形成的能力，被廣泛用于組織工程，以增加血液灌注并促進傷口愈合。

• 抗腫瘤作用：hAECs對某些腫瘤如上皮性卵巢癌細胞具有抑制作用，可能通過抗增殖和促凋亡，以及調節血管生成和細胞周期等，抑制腫瘤生長和侵襲。

這些特點使得hAECs在干細胞治療和再生醫學領域具有重要的應用潛力。

03人羊膜上皮細胞的表征與擴增

盡管許多臨床研究已證實hAEC具有治療作用，但目前的體外培養擴增系統限制了其應用。原代hAEC的產量和生物學特性受產婦身體狀況、胎盤大小和質量、不同羊膜部位的來源、妊娠階段、分離和保存程序等多種因素影響。從羊膜中分離的hAEC平均數量約為1×10^8，而單次治療通常需要0.5~1×10^8之間的數量，這導致同質細胞可能不足以對同一患者進行多次治療。

因此，獲得符合良好臨床實驗室規范 (GCLP) 標準的hAEC已成為一項絕對挑戰。開發一種足以在體外擴增hAEC的系統需要了解hAEC的特性及其增殖機制。

04人羊膜上皮細胞的細胞標志物

人羊膜上皮細胞（hAEC）的細胞標志物包括多種胚胎干細胞標記物和多潛能干細胞的轉錄因子。以下是一些關鍵的hAEC細胞標志物：

• 胚胎干細胞表面抗原：hAEC表達胚胎干細胞表面抗原，包括SSSEA-3和SSSEA-4，以及腫瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81。
• 多潛能干細胞的轉錄因子：hAECs還表達多潛能干細胞的轉錄因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等。
• 其他抗原：hAECs還表達ATP流出泵的ATP結合暗盒超級家族成員之一的ABCG2/BCRP、CD9、CD24、上皮鈣黏蛋白、整合素α6和β、肝細胞生長因子結合受體（c-met）等。
• 不表達的標記物：hAECs不表達CD34（造血干細胞及內表干細胞表面標記）、SSSEA-1、CD133（造血干細胞、內皮細胞及惡性膠質瘤細胞表面標記），弱表達c-kit(CD117)和CC趨化因子受體（CRR4）。
• 上皮標志物：hAECs表達上皮標志物角蛋白CK19，不表達間充質細胞標志物波形蛋白。
• 其他表達的分子：hAECs表達胚胎干細胞相關分子CD9, E-cadherin, PODXL, SSEA-4, SOX2, SSEA-1, Nanog, Oct-3/4。

這些標志物有助于識別和區分hAECs，并在研究和臨床應用中具有重要意義。

05人羊膜上皮細胞的增殖機制

人羊膜上皮細胞（hAECs）的增殖機制涉及多個方面，以下是一些關鍵點：

• EGFR/ERK1信號軸的調節作用：研究表明，hAECs可以通過激活EGFR/ERK1信號軸來促進軟骨細胞的增殖和細胞外基質的合成，并抑制其凋亡。這表明hAECs可能通過類似的機制影響自身的增殖。
• 抗氧化自由基能力：hAECs內含有多種分化酶，這些酶可以提高人體抗自由基的能力，包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶等，這些活性因子可能間接影響細胞的增殖和代謝。
• 旁分泌因子的作用：hAECs能夠分泌多種營養和免疫調節因子，這些因子可以重塑受損組織中的局部微環境，從而修復受損細胞和組織，并且這些營養因子和免疫調節因子可能在血管生成、免疫反應、細胞周期和細胞凋亡等生物學過程中起作用。這些旁分泌因子可能對hAECs的增殖有直接或間接的影響。
• 自我更新和分化潛能：hAECs表達多能干細胞特異性轉錄因子，例如OCT-4、SOX-2和Nanog，這些因子對于維持其自我更新和分化潛能至關重要，也可能影響其增殖能力。
• 無致瘤性：hAECs缺乏端粒酶，這決定了其在體外擴增不超過6代，避免了干細胞臨床應用的致瘤性，這可能與其增殖機制有關，即它們在一定代數后會自然停止增殖。

這些機制共同作用，可能影響hAECs的增殖和維持其功能。

06細胞療法的現狀

干細胞療法近年來已成為再生醫學的重要一環。常用的細胞類型包括多能干細胞、胚胎外組織來源的細胞和成體干細胞。在干細胞臨床應用中，造血干細胞（HSC）移植占據主導地位，間充質干細胞（MSC）研究則位居第二。

hAEC是形態上皮細胞，具有低免疫原性、免疫調節和抗炎作用。此外，hAEC缺乏端粒酶活性和可持續細胞分裂的潛力，使它們具有低致瘤性。因此，hAEC被認為是細胞治療的有希望的候選者（圖2）。

盡管對于hAEC治療疾病的分子機制存在一些不確定性，無論是體內植入和分化，還是調節生化反應和細胞對損傷的反應，Wallace團隊的工作已經清楚地證明hAEC無需植入或分化即可發揮修復作用。他們認為hAEC修復肺損傷的主要機制可能是向周圍組織發出旁分泌信號以減少促炎和促纖維化介質。在腦缺血、帕金森病、脊髓損傷和傷口愈合方面的研究也發現了類似的結果。

07

5項關于人羊膜上皮細胞“從實驗室到臨床”的研究

1981年，Akle等首次分離出原代hAEC，并將其移植到7名志愿者的上臂皮下。4周后，研究人員觀察到所有志愿者的血液中均沒有檢測到HLA抗體，其中2名志愿者也沒有出現淋巴細胞反應，這表明移植hAEC不會引起急性免疫排斥反應。

此后，利用hAEC進行細胞治療已成為一種新興的疾病治療方法。此后，許多研究顯示hAEC在臨床前治療中具有令人滿意的效果，但在臨床研究方面卻很少有結果。

截至2024年11月，數據庫中列出了25項臨床試驗（ClinicalTrials.gov、Anzctr.org.au 等），這些試驗使用“人羊膜上皮細胞”作為治療各種疾病的生物干預措施（表2），最有前景的包括神經系統疾病、免疫疾病和組織修復。

人羊膜上皮細胞治療神經系統疾病

大量研究表明，hAEC具備神經元的某些生化特性，盡管具有分化為神經細胞的潛力。hAEC在治療神經系統疾病方面最普遍接受的觀點與其旁分泌信號有關。已證明hAEC能夠合成和分泌神經營養因子、生長因子和神經遞質，如兒茶酚胺和多巴胺，這些物質有助于促進受損神經細胞的再生。hAEC還能分泌抗炎因子，有助于減少神經炎癥，改善細胞微環境，減緩疾病的進展過程。

越來越多的證據表明，在神經系統疾病動物模型中使用hAEC可以減少細胞凋亡，修復受損神經元，重建受損神經連接。有研究表明，hAEC有望成為神經系統疾病細胞療法的候選對象。本文，我們將重點介紹hAEC在帕金森病和阿爾茨海默病中的研究。

人羊膜上皮細胞治療帕金森病

帕金森病（PD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病。迄今為止，PD仍無法治愈，目前可用的臨床治療旨在減緩疾病進展和緩解運動癥狀。在過去的幾十年里，除了傳統的藥物和手術治療外，越來越多的新療法被用于治療PD。細胞療法在這些療法中發揮了重要作用并取得了顯著的成果。

大量動物研究表明hAEC在PD治療中具有良好的治療潛力。

• Zhang等進行的研究發現，hAECs立體定向移植至PD小鼠紋狀體，可促進神經突和軸突纖維的生長，抑制受損多巴胺能神經元的凋亡，有助于維持神經細胞的生物學功能。同時，hAECs條件培養基也可促進體外神經突的生長，提示hAECs可能通過分泌神經營養因子來增強神經細胞的自我修復。

盡管許多研究表明hAEC能夠緩解PD癥狀，但其潛在機制尚不清楚。已證明hAEC分泌的神經營養因子，如腦源性神經營養因子 (BDNF)、膠質細胞源性神經營養因子 (GDNF)、睫狀神經營養因子 (CNTF)、制瘤素M (OSM) 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF) 可在神經突生長、軸突生長、突觸可塑性和神經細胞表型方面促進神經細胞的存活和再生。這些研究提供了一種觀點，即hAEC有望成為一種新的PD治療方法。

人羊膜上皮細胞治療阿爾茨海默病

阿爾茨海默病 (AD) 是一種與年齡相關的進行性神經退行性疾病，與記憶力減退和認知障礙有關。目前，AD尚無明確的治愈方法，目前可用的治療干預措施無法逆轉甚至阻止AD的進展過程。

• 與帕金森病類似，hAEC對AD動物模型也有良好的治療作用。據報道，通過立體定向注射或靜脈注射將hAEC移植到AD小鼠模型（Tg轉基因小鼠）的側腦室，可顯著改善其行為表現，同時減輕空間記憶缺陷，促進前腦海馬區膽堿能神經元生長，并增加乙酰膽堿的產生。
• 此外，hAEC移植可減少Aβ沉積形成的斑塊并降低β-分泌酶 (BACE) 活性，而BACE活性對于調節Aβ40和Aβ42的產生至關重要。

這些研究表明hAECs將成為治療AD的有希望的候選藥物。

人羊膜上皮細胞治療免疫疾病

hAEC具有免疫調節特性。因此，hAEC有望在免疫疾病的臨床應用中擴大其治療潛力。在我們之前的研究中，將hAEC移植到通過在NCG小鼠中注射人PBMC建立的急性GVHD小鼠模型中，顯著減少了炎癥細胞向靶器官和器官病變的浸潤，提高了小鼠的存活率，延長了它們的壽命。

基于這些動物研究，2022年，中國國家藥品監督管理局 (NMPA) 藥品審評中心 (CDE) 批準了hAEC用于aGVHD治療的首個新藥研究 (IND) 申請，并于2023年11月啟動了I期臨床試驗。這項I期臨床研究的結果將加強hAEC在治療其他免疫疾病方面的應用潛力。

大量研究表明，hAECs和hAECs條件培養基 (hAECs-CM) 具有多種免疫調節和抗炎特性。它們分泌多種抗炎因子，如MIF、TGF-β、IL-10和PGE2，因此，hAECs可以有效抑制T細胞增殖和活化，減少促炎細胞因子的產生。

hAEC已用于治療多種免疫介導的炎癥疾病，如自身免疫性葡萄膜炎、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、糖尿病和多發性硬化癥 (MS)。

人羊膜上皮細胞治療組織損傷與修復

hAEC的生物學功能包括保護胎兒免受機械損傷，分泌激素和因子，支持胚胎發育，因此hAEC也可能有利于組織修復。關于hAEC在組織修復中的應用研究很多，包括子宮、卵巢、腎臟、角膜、肝臟和肺臟的損傷。

關于hAEC作為組織修復生物干預的臨床研究也在宮腔粘連（NCT03381807）、Asherman綜合征（NCT03223454）、原發性卵巢功能不全/卵巢早衰/不孕癥（NCT02912104、NCT03207412）、支氣管瘺（NCT02959333）、痙攣性腦癱（NCT03107975）和不愈合骨折（NCT03031509）等領域進行。

在一項關于持續性角膜上皮缺損 (PED) 的臨床研究中，發現hAEC與膠原蛋白護盾結合使用可促進PED消退。1例患者接受兩輪hAEC接種膠原蛋白護盾治療后，PED完全消退；2例患者接受四輪hAEC接種膠原蛋白護盾治療后，PED完全消退；所有患者接受治療后7至12周內出現視力下降，且所有患者均保持臨床改善，平均隨訪時間為6.3個月。

除了上述情況的應用外，hAEC還表現出對心肌梗塞、腦出血、視網膜變性、肺泡缺損、肺損傷、慢性肝功能衰竭、腺體損傷、內耳損傷等的治療潛力。所有這些都需要未來的臨床研究，然后才能轉化為治療產品來幫助患者。

08結論和未來挑戰

盡管近年來干細胞療法在治療各種疾病方面取得了進展，包括ESC、iPSC和MSC，但關于它們的效力、穩定性、致癌性、免疫反應、細胞來源和倫理道德方面仍存在許多不清楚的問題和未解決的問題。人們對其治療潛力的主要擔憂是致瘤性高風險和侵入性。

hAEC來源于人羊膜，作為醫療廢物，羊膜易于獲取且倫理爭議較少，并且不具有致瘤性和低免疫原性潛力。人們已經研究了hAEC在各種疾病中的應用，并探索了相關的潛在機制，使其成為治療疾病的更好的替代細胞來源。

參考資料：Yang J, Lu Y, Zhao J, Luo Y, Hao W, Zhang W and He Z (2024) Reinvesting the cellular properties of human amniotic epithelial cells and their therapeutic innovations. Front. Immunol. 15:1466529. doi: 10.3389/fimmu.2024.1466529

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